海南花梨木dna条形码序列测定毕业论文

毕业论文（设计）题目：海南花梨木DNA条形码序列测定学号：姓名：年级：学院：系别：专业：指导教师：完成日期：海南花梨木DNA条形码序列测定⑤待IPTG和X-gal被吸收后，取200µL菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中过夜培养（为得到更多的克隆，4000转/min离心1min,弃掉部分上清，保留100-150µL，轻弹悬浮菌液，取全部菌液涂板）。（3）蓝白菌斑筛选超净工作台上挑选白色单菌落，置于LB培养基中(含氨苄青霉素)，37℃恒温震荡培养5-6h；鉴定阳性克隆需要以培养的菌液为模板，菌液PCR扩增目的条形码片段。PCR反应体系与反应以鉴定阳性克隆，PCR反应体系及条件与以叶片DNAPCR扩增目的片段体系条件一致。2.4.4测序 将鉴定转化后的菌液中的11,22,25,30,34,40,43共七个样品寄送深圳华大基因科技有限公司实验室测序，采用ABI3730XL测序仪，采用正反双向测序确保测序结果的可信度，采用DNAStarLasergene6软件处理返回的序列，拼接和去引物。得到各样本的片段序列信息。3结果与分析 3.1条形码片段PCR扩增结果DNA条形码鉴定研究工作的核心在于筛选和鉴定，探索出合适的扩增引物，摸索建立起高效的扩增条件体系，然后评估对候选条形码序列的PCR扩增成功率，以及测序所得高质量的序列的测序成功率。这是对条形码片段的初步评估。扩增，测序成功率的高低直接影响了后续条形码序列分析。通过实验得到三种引物PCR扩增结果如下图，matK片段的扩增成功率低，在凝胶成像图中找不到条带。trnH-psbA片段和ITS2片段，均有结果。而经过纯化后的产物凝胶显示ITS2的条带更为清晰。图1.三种引物的PCR扩增产物电泳分析Figure1.ElectrophoreticanalysisofthreekindsofprimersforPCRproductsM:DNAmarker(AL2000)1-2:ITS2;3-4:trnH-psbA,;5-6:MatK图2.PCR扩增产物纯化电泳分析Figure2.ElectrophoreticanalysisofpurifiedPCRproductsM:DNAmarker(AL2000)1-3:ITS2;4-6:ITS2;7-9:trnH-psbA3.2条形码片段测序结果将回收得到的trnH-psbA片段、ITS2片段进行克隆，菌液PCR验证（图3），挑取检测效果较好的条带测序。测序结果中:样品DNA的trnH-psbA片段均未得到对应序列，只得到ITS2序列长度为654bp如下：ACCTGAGGTCGCGTCGTGGGCGATCGACATCGCTCGCGGGTCGCTGGGTACGGAGCTGGTGGAGGCCGCCCTCATGACTGGCCTCGAGAACACGCTCAACCACCGTCTGTCATGGCGCTGCATCCACCACGAACCCGATTTTCAGCCAGCCGCGAGGCGGTGCTCACGGGAGGCCAGCATTCGCCCCGCTCCGTGGCCGGAGGCACAGGGGTTGGGGCGGCGATTGGTGACACCCAGGCAGGCGTGCCCTTGGCCTAGTGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTTGGACTCGAGTGTTGCGACGTCGCCCGTGCGAGCACCGTTTCCGGGCCGACGGGACGCGCTCTGCGATTGTTGATTCCTTGGCGCTTTCCGCGCCGGGGTTTGTTGGTTGTTTCGCCGGGACGAGAGGCCGCGGGGCGCGGCTCCGTCCCGACTTTGAGGGAAGGCGAGCTGCTGGGCAGCTTCGTCTGTCCCGGGTGTTGAAACGTGTCCGCGGGTCTCTCTGGATTGAGGCATAAGGGCAATTCTGCAGATATCCATCACACTGG图3克隆菌液PCR产物电泳检测Figure3.ElectrophoreticanalysisofPCRproductsofcloningescherichiacoliM:DNAmarker(AL2000)ITS2:1-38;trnH-psbA:39-483.3序列分析根据NCBI中已登录的黄檀属分子的ITS2序列，用DNAMAN做比对。样品ITS2分子序列黄檀属其他植物均不同，其中与越南黄檀差异最小有8个位点碱基不同，其次是多裂黄檀有15个碱基不同。表1.降香黄檀、越南黄檀和多裂黄檀的特异性鉴别位点Table1IdentificationsitesofDalbergiaodoriferaT.Chen,DalbergiatonkinensisandDalbergiarimosaRoxbindifferentoriginsitesN0.位点327078345406435441530597635636637638639642645样品CGTAGTCGGGGGCATG越南黄檀CTTAGTCGGCAATGCT多裂黄檀TGGGTGTCACAATGCT通过NCBI中已登录的黄檀属其他13个树种和国槐属植物国槐的ITS2序列，所得序列进行多重比对后采用邻接(NJ)法构建系统进化树(见图4)。结果显示，外类群槐属植物的国槐单独聚为一枝，与传统分类结果相一致。系统发育树结果说明降香黄檀与越南黄檀有着较近的亲缘关系其次才是多裂黄檀，但它们又不属同一植物类群，且三者有着稳定的遗传差异性。图4降香黄檀ITS2序列与其他物种该序列的进化树分析Figure4.PhylogenytreeobtainedbymethodbasedontheITSsequnence4结论与讨论4.1结论实验结果表明降香黄檀DNA片段，用三种特异性引物扩增MatK，trnH-psbA，ITS2片段，其中trnH-psbA，ITS2均有扩增产物但只有ITS2通过PCR扩增成功，且扩增成功的DNA片段可用于测序分析，对降香黄檀分子条形码测定的有效性最高。通过NCBI查询降香黄檀ITS2序列和其他黄檀属植物不同，其中与越南黄檀差异最小其次是多裂黄檀，多重比对后构建降香黄檀、越南黄檀和多裂黄檀的系统发育树显示了三者有相当近的亲缘关系又不属于同一物种。建议把ITS2作为鉴定降香黄檀的候选片段。4.2讨论随着社会的不断进步和经济的高速发展，人们对木质材料，特别是高档木材制品的需求日益增加，出现了大量的非法采伐和过度采伐的现象。同时由于高档珍稀木材与普通木材在价格上有着大较的差异，在经济利益的驱使下，高档木制品市场上出现了大量的假冒伪劣产品，给消费者造成了非常大的经济损失。因此，为维护消费者合法利益，规范木材贸易市场，以及保护生态环境，对木材进行快速、准确、科学的识别鉴定就显得十分重要和迫切。本研究以基地种植的降香黄檀（DalbergiaodoriferaT.Chen）为研究对象，通过叶片DNA提取、纯化和ITS序列测序，从而揭示降香黄檀和越南黄檀、多裂黄檀DNA序列之间的差异，为降香黄檀木材种属鉴定提供可靠的分子标记依据。本研究中有一些后续仍需要改进的地方，比如：运用了较为易于提取DNA的叶片，可以为苗木鉴定提供可行的检测手段，但在实际应用中市场上辨别木材是很难找到对应的叶片用于检测，而木材DNA的提取与扩增相对于叶片比较困难。

致谢岁月如梭，如歌。转眼间，大学四年美好的学习时光已接近尾声。感谢一直在身边陪伴着我，呵护我成长的父母；衷心的感激这些年来对我悉心教导，诲人不倦的老师们；感谢在学习中给予我支持与帮助的同学；感谢在四年宿舍生活中，包容我，鼓励我的舍友们。感谢这一路走来都有你们，能让我能在遇到困难的时候，有勇气克服困难，爬起来继续往前走。毕业论文得以顺利完成，我要衷心的感谢W老师，感谢老师在在繁忙的授课与科研中抽出时间给予耐心的教导和帮助。此外我还要感谢实验室的师兄师姐，特别是L师姐对我耐心的帮助，悉心的指导。在此我还要感谢和我一起做《降香黄檀分子条码确定》的M同学花了一个暑假的时间提出了降香黄檀的DNA。谢谢你们。我知道明天有风雨也有彩虹，我有勇气、自信和能力经历风雨迎接彩虹，不辜朋友，老师和家人的期望！

参考文献[1]姜爱莉,孙利芹.降香抗氧化成分的提取及活性研究[J].精细化工,2004,21(7):525-528.[2]张磊.刘干中.降香的中枢抑制作用[J].上海中医药杂志,1987,12:39-40.[3]何明通.海南岛降香资源的调查[J].中药材,1987,6:20-21.[4]马文辉,钟琼芯,符永登.海南省珍稀濒危植物和重点保护野生植物[J].海南师范学院学报,2003,16(4):68-71.[5]毕和平,宋小平,韩长日,等.降香檀叶挥发油成分的研究[J].中药材,2004,27(10):733-735.[6]黄晓丹,张云贵,应铁进.高质量植物基因组DNA的提取[J].植物生理学通讯,2006,42(2):311-314[7]杨新全,冯锦东,魏建和,等.我国特有濒危药用植物降香黄檀遗传多样性研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2007,9(2):73-76．[8]孟慧,谢彩香,杨云,等.降香黄檀产地适宜性分析[J].时珍国医国药,2010,21(9):73-77.[9]李大周,曾祥全.海南黄花梨栽培技术[M].海口:三环出版社,2007.[10]马文辉,钟琼芯,符永登.海南省珍惜濒危植物和重点保护野生植物[J].海南师范学院学报,2003,16(4):68-71.[11]FloydR.,AbebeE,PapertA.etal.Molecularbarcodesforsoilnematodeidentification.MolEcol[J].2002,11(4):39-50.[12]HebertPD,RatnasinghamS,DeWaardJ.R.Barcodinganimallife:cytochromecoxidasesubunit1divergencesamongcloselyrelatedspecies.ProcBiolSci,2003,270:96-99.[13]马兰,黄原.生物分类学发展的新方向——DNA分类学[J].黄冈师范学院学报.25,40-43.[14]HebertPD,GregoryTR.ThepromiseofDNAbarcodingfortaxonomy[J].SystBiol,2005,54(5):852-859.[15]TaberletP,CoissacE,PompanonF,etal.PowerandlimitationsofthechloroplasttrnL(UAA)intronforplantDNAbarcoding[J].NucleicAcidsRes,2007,35(3):4.[16]裴男才.利用DNA条形码技术识别植物物种[J].应用生报,2012,05:1240-1246.[17]伏建国,刘金良,杨晓军,等.分子生物学技术应用于木材识别的研究进展[J]..浙江农林大学学报,2013,30(3:438-443.[18]DeguillouxM.F,PemongeM.H,PetitR.J.Novelperspectivesinwoodcertificationandforensics:drywoodasasourceofDNA[J].ProcBiolSci,2002,269(1495):1039-1046.[19]JiaoLC,YinYF,XiaoFM.ComparativeanalysisoftwoDNAextractionprotocolsfromfreshanddriedwoodofCunninghamiaLanceolata(Taxodiaceae)[J].IAWA.Journal,2012,33(4):441-456.[20]刘金良,伏建国,杨晓军,等.进口针叶木木材的DNA提取与分子鉴定方法[J].中南林业科技大学学报,2012,08:131-136.[21]杨振艳,张玲.姜科砂仁属植物DNA条形码序列的筛选[J].云南植物研究,2010,05:393-400.[22]王以红,陶晓瑜,刘海龙,等.两个叶绿体基因位点的DNA条形码在桉属种间鉴定中的应用[J].园艺学报,2009,11:1651-1658.[23]ChenS,YaoH,HanJ,etal.ValidationoftheITS2regionasanovelDNAbarcodeforidentifyingmedicinalplantspecies[J].PLoSOne,2010,5(1):e8613.[24]李妮,陈科力,刘震,等.景天属药用植物DNA条形码研究[J].世界科学技术(中医药现代化),2010,03:463-467.[25]刘美子,刘萍,李美妮,等.党参及其易混伪品的ITS2分子鉴定.世界科学技术[J].中医药现代化,2011,02:412-417.[26]宋朝枢,徐荣章,张清华.中国珍稀濒危保护植物[M].北京:中国林业出版社,19891.[27]李桂兰,徐峰,罗建举.海南香枝木与越南香枝木木材构造特征比较解剖研究[J].广西农业生物科学,2008,27(2):154-157.[28]叶丽,基于Web的世界主要商用木材信息查询系统的研究[D].南京:南京林业大学,2007.[29]张浩.基于DNA条形码技术的降香黄檀与多裂黄檀木材识别研究[J].安徽农业大学学报,2013,6:96-101.基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究基于单片机的嵌入式Web服务器的研究MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器单片机控制的二级倒立摆系统的研究基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现基于单片机的蓄电池自动监测系统基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制目录TOC\o"1-4"\h\z\u269111前言 1125731.1分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展 170731.2研究的目的与意义 2105732材料与方法 368032.1材料 3HYPE