大学毕业论文-海藻酸钠硫酸酯的制备及结构表征

武汉理工大学毕业论文PAGEPAGE20武汉理工大学毕业论文海藻酸钠硫酸酯的制备及结构表征学院（系）：化学工程学院专业班级：制药专业0702班学生姓名：指导教师：目录摘要 IAbstract II1绪论 11.1多糖硫酸酯概述 11.1.1多糖的来源及研究现状 11.1.2多糖修饰的意义及主要修饰方法 11.1.3多糖硫酸酯的生物活性 21.1.4多糖及硫酸酯化多糖的活性与结构的关系 41.1.5多糖的硫酸酯化方法简介 61.2海藻酸钠硫酸酯概述 71.2.1海藻酸钠简介 71.2.2海藻酸钠硫酸酯的生物活性 71.2.3海藻酸钠硫酸酯的应用及研究现状 81.2.4海藻酸钠硫酸酯的制备方法 81.3本课题研究目的及意义 92实验部分 102.1实验试剂与仪器 102.2海藻酸钠硫酸酯的制备及表征 112.2.1海藻酸钠硫酸酯的制备 112.2.2海藻酸钠硫酸酯取代度的测定 112.3红外表征 122.4海藻酸钠硫酸酯制备的因素考察 122.4.1投料比海藻酸钠硫酸酯取代度的影响 122.4.2反应时间对海藻酸钠硫酸酯制备的影响 122.4.3反应温度对海藻酸钠硫酸酯制备的影响 123结果与讨论 133.1海藻酸钠硫酸酯的红外光谱图谱 133.2海藻酸钠硫酸酯的取代度 143.2.1硫酸钡标准曲线 143.2.2海藻酸钠硫酸酯的取代度所得数据如表3-2所示。 153．3制备海藻酸钠硫酸酯的最优反应条件 153.3.1硫酸酯化试剂和海藻酸钠的比例对取代度的影响 153.3.1反应时间对海藻酸钠硫酸酯制备的影响 163.3.1反应温度对海藻酸钠硫酸酯制备的影响 164结论 17参考文献 18致谢 20摘要海藻酸钠硫酸酯是海藻酸钠中单糖上羟基的氢被硫酸酯基取代所得到的产物。研究表明，海藻酸钠硫酸酯和天然的抗凝血物质肝素有着很相似的结构，血液中加入海藻酸钠硫酸酯后，其凝固时间明显延长。这表明海藻酸钠硫酸酯具有抗凝血功能。此外，海藻酸钠硫酸酯同其他多糖硫酸酯一样还具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。但目前人们对海藻酸钠硫酸酯的研究还很少，因此，海藻酸钠硫酸酯有很广的研究前景。本论文研究的是海藻酸钠硫酸酯的制备。以海藻酸钠为原料，用直接浓硫酸法对海藻酸钠进行酯化修饰。利用傅里叶变换红外光谱仪对产物进行结构表征并用BaCl2-明胶法对产物取代度进行测定。研究结果表明：直接浓硫酸法能够将硫酸基成功的接到海藻酸钠上。投料比、反应温度和反应时间对产物的取代度和纯度都有影响，且温度低、浓硫酸与海藻酸钠的投料比为6:1、反应时间为3h左右时海藻酸钠硫酸酯的产量较高，取代度也较高。关键词：多糖硫酸酯；海藻酸钠；海藻酸钠硫酸酯；取代度

AbstractSodiumalginatesulfatesaretheproductsofsodiumalginateonwhichthehydrogenofthemonosaccharidearereplacedbythesulfategroups．Studiesshowthatsodiumalginatesulfateshavethemostsimilarstructureofheparinwhichisanaturalanticoagulant,andwhenhumanplasmaareaddedwithsodiumalginatesulfates,itsclottingtimewillbeprolonged．Thisindicatesthatthesodiumalginatesulfateshaveanticoagulantactivity．Besides,sodiumalginatesulfateslikeotherpolysaccharidesulfatesalsohavebiologicalpharmacologicalactivitiesofantiviralactivity,antioxidant,anti-tumorandsoon．However,thecurrentstudiesonSodiumalginatesulfatesarestilllittle．ThismeansthatthestudyonSodiumalginatesulfatesisofmuchprospect．Thispaperismainlyaboutthepreparationofsodiumalginatesulfates．Sodiumalginatewasusedastherawmaterialandesterificationmodifiedbyconcentratedsulfuricaciddirectly．Fouriertransforminfraredspectrometer(FTIR)wasusedtocharacterizethestructureoftheproducts．Thedegreeofsubstitution(DS)oftheproductswasdeterminedbythemethodofBaCl2-gelatin．Theresultsshowedthatsulfategroupscouldbejoinedintosodiumalginatesuccessfullybythismethod．Theratioofconcentratedsulfuricacidtosodiumalginate,thereactiontemperatureandreactiontimehadsignificantinfluenceontheDS．Theoptimalconditionofthereactionwaswhentheratiois6:1,andthereactiontimewas3hwithlowtemperature．KeyWords：Polysaccharidesulfate；sodiumalginate；sodiumalginatesulfates；degreeofsubstitution1绪论1.1多糖硫酸酯概述1.1.1多糖的来源及研究现状天然多糖是生物体内一类重要大分子，是组成生物高分子家族中的一个丰富多彩的成员，广泛存在于植物、动物和微生物组织中。多糖具有很多重要的生物功能，其中两种最重要的功能是结构物质和能量物质，如组成植物细胞壁的纤维素和组成虾蟹的甲壳属于结构物质，而淀粉和纤维素等则作为能量物质。除了储存能量和支持结构外，多糖还是一类重要的信息分子，在生物体内起着传递信息的功能。近二十多年来，研究者们发现多糖及其缀合物广泛参与细胞的各种生命现象的调节，如免疫细胞间信息的传递和感受，这与细胞表面的多糖体的介导有密切关系。而且多糖又是细胞表面对各种抗原和药物的受体，因此多糖仅作为支持组织结构和动植物能量来源的传统观念已被突破。另外，人们还发现一些多糖如香菇多糖、云芝多糖等能够治疗免疫系统受到损伤而引发的一些疾病，无毒副作用，是一类有很大开发潜力的免疫调节剂，特别是多糖的一些衍生物，如硫酸酯化多糖，具有抗凝血、抗肿瘤和抗病毒等药理学活性。目前研究较多的天然多糖有真菌多糖、植物多糖、海洋生物多糖。有关真菌多糖的化学成份和结构的报道甚多，例如对灵芝多糖、香菇多糖、当归多糖等的研究。但是，随着有机高分子合成技术和分离技术的不断发展，人们对多糖的研究已不仅仅局限于从天然动植物中提取。人们开始合成很多有很好生物活性的多糖，或者是对天然多糖进行适当的结构修饰，使其有更好的生物活性或者降低其毒性或副作用。1.1.2多糖修饰的意义及主要修饰方法多糖广泛参与细胞的各种生命活动从而产生多种生物学功能，如增强免疫特性、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、延缓衰老等功能。但是，在对多糖的结构及其活性的研究中，研究人员发现以下问题：(1)自然界中存在的多糖并不都具有活性。例如,一种从土壤微生物中提取的多糖curdlan,尽管与多糖药物—香菇多糖有相似的主链结构,却没有后者所具有的抗肿瘤活性；(2)有些多糖由于结构或理化性质等障碍而不利于其生物学活性的发挥。如未经处理的裂褶多糖由于粘度太大而在临床上无法使用;一些硫酸葡聚糖因分子量大，无法跨越多重细胞膜障碍，很难达到发挥生物学活性的血药浓度；(3)也有些多糖尽管药效良好，但同时也会产生一些不良反应，甚至毒副作用。如有些具有抗病毒活性的低分子量硫酸葡聚糖可产生不利于其抗病毒活性的抗凝血现象；某些多糖硫酸酯化衍生物由于硫酸酯基过多而显示一定的细胞毒性；(4)有些从天然生物体内分离的多糖活性较弱，有待进一步提高。因此，为了充分发挥多糖的应用价值，对天然多糖进行结构修饰以改善多糖的性质已变得十分有必要。目前多糖的修饰方法主要有以下几种：1．化学方法修饰。包括：硫硫酸酯化修饰，即在组成多糖的单糖元的羟基上引入硫酸酯基；乙酰修饰；磷酸化修饰；羧甲基化修饰；硒化修饰；其他化学修饰方法等。2．物理方法修饰。物理修饰主要是利用超声波对天然多糖进行结构修饰。超声修饰主要是通过增加多糖分子的质点振动能量来切断生物大分子中的某些化学键，从而降低分子量，增加水溶性，提高生物活性。3．生物方法修饰。工业上利用微生物繁殖迅速的特点大量生产活性多糖。但天然生物多糖不具备理想的活性结构。为了得到理想的结构，工业上通过操纵微生物基因表达或引入外源基因来控制微生物体内多糖合成途径，从而生产所需多糖。1.1.3多糖硫酸酯的硫酸酯化多糖(sulfatedpolysaccharides，SPS)也称多糖硫酸酯(polysac-charidessulfate，PSS)，是指多糖大分子链中单糖分子上某一个或几个羟基被硫酸根所取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效关系鲜明的多糖衍生物，为阴离子化合物，包括天然提取的多种硫酸多糖和化学合成的硫酸多糖。自1981年硫酸酯化木聚糖被批准用于治疗艾滋病毒（HIV）以来，硫酸酯化多糖的抗病毒活性研究一直备受关注，这也使其成为研究最多的一类天然的或人工化学修饰的多糖之一。经过近三十年的研究，人们对硫酸酯化多糖的结构及其活性有了更深入的了解。目前，人们对硫酸酯化多糖的活性研究主要有以下几个方面：抗病毒、抗凝血、降血脂、抗氧化、抗辐射、抗炎、抗呕吐等。其中对硫酸酯化多糖的抗病毒和抗凝血研究最为广泛。现就这几个方面的活性概述如下。硫酸酯化多糖的抗病毒活性许多天然的或经化学修饰的硫酸酯化多糖都有很好的抗病毒活性。如香菇多糖硫酸酯具有良好的抗HIV病毒的活性，抑制HIV酶类的活性许多体外试验表明，硫酸酯化多糖能有效地抑制HIV的逆转录酶(RT)活性，而未被硫酸酯化的多糖则没有这种作用；牛膝多糖硫酸酯在抗病毒实验中表现出良好的抑制HBsAg、HBeAg病毒作用；鲨鱼软骨多糖经硫酸酯化修饰后水溶性得到很好改善,并具有较强抗癌活性等。另外，黄芪多糖硫酸酯通过对BHK细胞毒性作用实验以及对HSV-1生物合成抑制作用的研究表明，其体外抗HSV-1的作用优于阿昔洛韦且毒性更低,也表明其对病毒感染的临床治疗具有应用前景。研究还表明，硫酸酯化多糖的抗病毒活性与产物的分子量大小、硫酸酯基取代的位置、硫酸酯基取代度、硫酸酯化多糖的主链结构和高级结构等都有密切关系。随着对多糖硫酸酯研究的进一步加深，人们对硫酸之化多糖的抗病毒活性有了较为清晰地认识。体外实验证明，许多硫酸酯化多糖的抗病毒活性是通过与病毒囊膜上识别宿主细胞表面受体的糖蛋白结合并干扰感染过程的启动来产生的在体内，不能吸附细胞的游离病毒易于被机体的免疫系统清除，这是硫酸酯化多糖抗病毒活性产生的主要和重要途径。硫酸酯化多糖的抗凝血活性经过对提取自动物体内的肝素的抗凝血研究发现其抗凝血活性与其结构中硫酸酯基有关。另外很多经硫酸酯化的多糖也有良好的抗凝血活性。基于此，研究人员猜想多糖衍生物的抗凝血活性与硫酸酯基有关。Doctor等人通过测定活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶原时间（PT），和凝血酶时间（TT），研究了15种半合成硫酸化多糖和肝素的体内、外抗凝活性。结果显示，这些半合成硫酸化多糖的体外抗凝血作用与肝素相当。而没有经硫酸酯化修饰的多糖抗凝血活性则很小，有的甚至不表现抗凝血活性。硫酸酯化多糖的抗凝血活性与硫酸化的位置和相对分子量大小有关。例如ShighehiroHirano等人得出的认识是C4位硫酸化是影响抗凝血活性的主要位点，对多糖的葡萄糖单元上的C4上的羟基进行硫酸酯化修饰后，多糖表现出更强的抗凝血性能。另外，C2位硫酸化可增强多糖硫酸纸的抗凝血活性。由此可知，硫酸酯化可以提高多糖的抗凝血活性。分子量大小与多糖硫酸酯的抗凝血活性有以下关系：Mw26000>肝素（2100）>Mw12000>Mw54000。此外，有研究发现多糖硫酸酯的毒性随着其分子量的增大而增强。为了得到活性高，毒副作用小的多糖硫酸酯，可以通过控制硫酸基取代度，及其取代基的位置来实现。硫酸酯化多糖的抗凝血机理主要是：硫酸酯化多糖中的硫酸酯基带有负电性，它可以中和生物体血液中组成凝血酶的氨基酸残基上的正电荷。而当氨基酸残基上的正电荷被中和后，血液中的凝血因子IIa和凝血酶Xa会受到抑制，从而使得血液的内源性凝固时间得以延长，即APTT和TT的时间会被延长。一般而言，硫酸酯基对血液的外源性凝血途径没有影响，即硫酸酯化多糖不能延长PT的时间。硫酸酯化多糖的其他活性简介近年来，硫酸酯化多糖的抗氧化作用受到广泛的重视。生物体的氧化代谢会产生阴离子自由基与羟基自由基(·OH)及活性氧，易引起生物体内脂质的发生过氧化，对细胞产生很大的毒性作用。研究表明许多多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化的作用，从而起到保护生物膜的作用。例如，研究表明海带褐藻多糖硫酸醋对超氧阴离子具有良好的清除作用，能够抑制羟基自由基诱导的红细胞氧化溶血，对FeSO4抗坏血酸体系造成的脂质过氧化具有良好的保护作用。其抗氧化机理是通过硫酸酯基对引起人体氧化的自由基进行清理，从而减少自由基对人体正常细胞的氧化。多糖类物质具有广谱的免疫调节活性，并能通过免疫调节作用发挥多种生理活性，硫酸酯化修饰后作用提高。杨铁虹等研究发现，当归多糖及其硫酸酯对脾细胞增殖具有促进作用，且与剂量有良好的相关性。多糖及其硫酸酯化修饰产物的调节免疫机理为：作为一种免疫调节剂，多糖能起到刺激机体各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，增加巨噬细胞非特异性细胞毒，诱导白细胞介素-l、白细胞介素-2、肿瘤坏死因子、干扰素等细胞因子的产生和细胞因子受体的表达，促进抗体形成，活化补体系统的经典途径及变更途径等作用。硫酸酯化多糖除了有以上几种活性外，还有抗炎和抗辐射等活性，但目前对于这两种活性的研究主要出于试验阶段，而且其机理也不很明确。1.1.4多糖及硫酸酯化多糖的活性与结构的关系多糖是所有生命有机体的重要组分，并在控制细胞分裂和分化、调节细胞生长和衰老以及维持生命有机体的正常代谢等方面有重要作用。而硫酸酯化多糖是多糖衍生物中十分重要的一种。近年来大量研究表明，多糖及硫酸酯化多糖的生物活性主要受多糖或硫酸酯化多糖的空间构象、硫酸根含量、分子量以及多糖的物理性质的影响。多糖及硫酸酯化多糖的多糖的结构复杂，这是因为组成多糖的单糖品种繁多，而且即使只有一种单糖，其连接方式也不同。例如，有的多糖可能有分支蛋白质而有的多糖也可能没有分支。为了更好地对多糖的结构进行分析与研究，研究人员将多糖的结构按其复杂程度分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。各级结构的分类标准及各自的组成特点如表1-1所示。表1-1多糖结构分级一览表一级结构包括糖基的组成、糖基的排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等二级结构多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系到多糖分子中主链的构象，不涉及到侧链的空间排布在多糖链中，糖环的几何形状几乎是硬性的，各个单糖残基绕糖普键旋转而相对定位，由此决定多糖的整体构象三级结构多糖链一级结构的重复顺序，由于糖单位的经基、梭基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用，导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象四级结构多聚链间艺非共价键的形式结合而成的聚集体不管是天然的还是合成的硫酸酯化多糖，其主要是多糖中的羟基被硫酸酯基取代，因此，硫酸酯化多糖的结构本质上与天然多糖的结构很相近。多糖及硫酸酯化多糖的活性与构象目前硫酸酯化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性，并且多糖的生物功能与其结构密切相关。多糖及其硫酸酯化衍生物的活性与其初级和高级结构特别是三维空间构象密切相关。例如，有研究表明硫酸酯化多糖的抗病毒活性与糖链空间结构有关。多糖经硫酸酯化后，糖链柔性降低。多糖引入硫酸基后，打破了原有的多糖之间的聚合链，使多糖构象得以伸展，另外，由于硫酸基之间的排斥作用导致糖环构象扭曲或者转变，使多糖卷曲构象呈伸展和刚性状态，可能是硫酸酯化多糖产生抗病毒活性的重要原因。多糖的生物学活性与其高级结构的精确关系尚不十分清楚，但高级结构比一级结构在活性方面起更大的作用，对于这一观点的认识则是一致的。有些多糖虽具有相同的一级结构，但活性相差很大，这主要是高级结构的不同引起的。因此，探索用更有力的方法研究多糖的高级结构，利用多糖的高级结构模型与生命细胞受体模型推断多糖的作用方式，可为活性多糖的筛选和改造多糖更具有生物活性提供必须的理论基础。硫酸酯化多糖的活性与硫酸酯基硫酸酯化多糖中的硫酸根在多糖活性中起着重要作用。对大多数硫酸酯化多糖，若将硫酸根去除,则其活性消失。硫酸酯基对硫酸酯化多糖的影响主要源于其较强的负电性和其立体结构的特异性。硫酸酯基对硫酸酯化多糖的活性影响主要表现在硫酸酯基取代的位置和取代度上。硫酸酯基的取代位置对硫酸酯化多糖生物活性活性影响。硫酸酯基取代组成多糖的糖单元上的羟基的位置不同，其表现出来的生物活性也不同。例如，Mulloy等通过核磁共振分析发现，保持硫酸基取代度不变，将硫酸软骨素B的C4位上的硫酸基变为C6位硫酸基，其抗凝血活性完全丧失，这表明C4位上的硫酸基发挥着抗凝血作用。硫酸酯基的取代度(DS)对硫酸酯化多糖生物活性的影响。硫酸酯基的取代度对硫酸酯化多糖的生物活性有很大的影响。一般而言，当取代度在一定范围时，取代度越大，则其生物活性越高。但并非硫酸根越多活性越强，分子中硫酸根过多会产生抗凝血等副作用。一些硫酸多糖因硫酸基过多而显示一定的毒性，经过脱去部分硫酸基(称多糖的脱硫修饰)，可降低其毒性。一般认为，在平均每单位糖残基含1.5～2.0个硫酸根，其生物活性最佳，例如，抗HIV活性最强的硫酸酯化香菇多糖组分DS为1.7左右。多糖的某些物理性质，如溶解度、粘度、相对分子质量大小等对多糖及其硫酸酯化衍生物的生物活性有很大影响。分子量大小对硫酸酯化多糖生物活性的影响。分子的大小是多糖具备生物活性的必要条件，这与保证高级结构的构象有关。一般认为，分子量在一定范围时，产物的活性随着分子量的增加而增加。如分子量大于100KD的裂褶多糖具有较强的抗肿瘤活性，而其低分子量（小于50KD）的片段无任何生物活性。另外，Duarte等由来源于Acanthophoraspicifera的硫酸化琼脂糖的抗疱疹病毒实验发现，当各个组分的硫酸根摩尔含量达40％时，随着分子量的升高，其抗病毒活性越来越强。但也有部分分子量小、无规则结构的多搪片段具有抗S180瘤活性。例如Pythiumaphaphanidermatum葡聚糖是分子量为10KD和20KD的无规则结构混合物，具有抗肿瘤活性。分子量过大的多糖及其衍生物，由于其很难透过细胞膜而进入药理作用位置，所以很难表现出生物活性。但是也有报道极少数分子量十分巨大却具有生物活性的多糖类物质。溶解度对硫酸酯化多糖生物活性的影响。大多数不溶或溶解度较低的多糖其活性较低，甚至不表现药理活性。但也有研究表明，少数多糖不溶于水，但是却又很好的药理活性。粘度对硫酸酯化多糖生物活性的影响。多糖的粘度主要是由于多糖分子间的氢键相互作用产生，还受多糖分子质量大小的影响它不仅在一定程度上与其溶解度呈正相关，还是临床上药效发挥的关键控制因素之一，如果豁度过高，则不利于多糖药物的扩散与吸收。1.1.5多糖的硫酸酯化方法简介目前，多糖硫酸化常用的方法有氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法等。硫酸化方法的原理为：溶于一定溶剂系统中的多糖与相应的硫酸化试剂在一定的条件下反应，使得多糖残基上的某些羟基接上硫酸基团。以氯磺酸试剂为例，多糖的硫酸化反应是在路易斯碱溶液中由-SO3H取代多糖羟基中的-H，经中和而得的多糖硫酸盐。现就各种方法简介如下。浓硫酸法该法用98%的浓硫酸作硫酸酯化试剂，正丁醇作为反应介质。主要步骤是，先将浓硫酸和正丁醇混合，然后加入待酯化的多糖进行反应。反应所的产物用NaOH中和至中性。产物离心后透析，再用95%乙醇来醇沉。产物干燥后既得多糖硫酸酯。该法操作简便易行，而且整个实验过程中所用到的仪器简单，药品也常见。这种方法不仅降低了反应成本而且也减少过程中污染物的长生。但是，该方法中，硫酸酯基的取代度不容易控制，而且浓硫酸有较强的脱水性和反应活性，这样也使得多糖水解的可能性增加，这会使得产物中副产物较多。改进该方法主要靠改变浓硫酸与多糖的投料比，并在反应过程中控制反应温度在较低的条件下。三氧化硫-吡啶法该法用三氧化硫作为硫酸酯化试剂，以吡啶作为反应介质。反应过程中，将三氧化硫加入到盛有吡啶的反应装置中。并在水浴加热条件下缓缓加入多糖进行反应。反应产物用NaOH中和至中性。反应产物用95%的乙醇进行醇沉，透析。透析后再经过滤后恒温干燥既得硫酸酯化多糖。该法的优点是，反应中副产物较少，反应产率较高，而且产物的硫酸酯基取代度也较理想。但反应过程中要用水浴加热，操作相对复杂。另外，由于吡啶有很强的毒性，因此很容易造成环境污染。氯磺酸-吡啶法吡喃型多糖常用氯磺酸－吡啶法进行修饰。该法以氯磺酸为硫酸酯化试剂，以吡啶为反应介质。主要步骤是，将反应装置置于盐水冰浴中，加入吡啶，搅拌使之冷却；用滴液漏斗加氯磺酸，再加入多糖粉末,迅速将装置移入沸水浴中进行反应，反应完毕，冷却至室温，在冰水中用NaOH中和，乙醇醇沉，离心，透析，过滤。滤液冻干后即得多糖硫酸酯。此法产物回收方便,回收率较高。但该法中，氯磺酸和吡啶的价格相对昂贵，而且该法中既用到冰水浴，又用到沸水浴，而且连着操作间期很短，这样对反应仪器要求很高，而且对操作要求也很高。1.2海藻酸钠硫酸酯概述1.2.1海藻酸钠简介海藻酸钠，也可称为褐藻酸钠、海藻胶，是一种天然多糖。它主要由海藻酸的钠盐组成，由a-L-甘露糖醛酸(M单元)与b-D-古罗糖醛酸(G单元)依靠1,4-糖苷键连接并由不同GGGMMM片段组成的。其分子式为(C6H7O8Na)n，结构式如右图所示：海藻酸钠的理化性质海藻酸钠为白色或淡黄色粉末，几乎无臭无味；溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。溶于水成粘稠状液体，1％水溶液pH值为6-8。当pH＝6-9时粘性稳定，加热至80℃以上时则粘性降低。海藻酸钠无毒，LD50＞5000mg／kg。海藻酸钠具有吸湿性，平衡时所含水分的多少取决于空气的相对湿度。干燥的海藻酸钠在密封良好的容器内在25℃及以下温度储存相当稳定。聚合度和分子量与海藻酸钠溶液的粘性直接相关，储藏时粘性的降低可以用来估量海藻酸钠去聚合的程度。高聚合度的海藻酸钠稳定性不及低聚合度的海藻酸钠。海藻酸钠溶液在pH5～9时稳定。海藻酸钠粉末遇水变湿，微粒的水合作用使其表面具有粘性。然后微粒迅速粘合在一起形成团块，团块很缓慢的完全水化并溶解。如果水中含有其它与海藻酸钠竞争的水合化合物，则海藻酸钠更难溶于水中。水中的糖、淀粉或蛋白质会降低海藻酸钠的水合速率，混合时间有必要延长。海藻酸啊在1％的蒸馏水溶液中的pH值约为7．21.2.2海藻酸钠硫酸酯的生物活性海藻酸钠硫酸酯是由海藻酸钠作原料以硫酸酯基取代海藻酸钠单糖上的羟基而制的。海藻酸钠作为一种常规的海洋藻类多糖提取物，其有着和其他多糖类似的结构和性质，因此其硫酸酯化产物也有着硫酸酯化多糖相似的生物活性。目前，人们主要对海藻酸钠硫酸酯的抗凝血活性、抗放射性和抗病毒活性进行实验研究。目前，人们对海藻酸钠硫酸酯的抗凝血研究比深入。海藻酸钠硫酸酯的抗凝血活性。人们对天然多糖进行硫酸酯化后发现，产物大都与血液有很好的相溶性，有的甚至表现出抗凝血性。而海藻酸钠作为一种重要的海洋生物提取多糖，其硫酸酯化产物也有着很好的抗凝血活性。1913年Killing首次从褐藻中提取了具有抗凝血活性的海藻酸钠硫酸酯。海藻酸钠硫酸酯的抗凝血活性与硫酸酯基有着密切关系。硫酸酯基的取代位置和其取代度对海藻酸钠硫酸酯的抗凝血活性都有很大影响。海藻酸钠硫酸酯的抗病毒活性。海藻酸钠硫酸酯不仅有抗凝血性能还有抗病毒活性。有研究表明海藻酸钠硫酸酯有很好的抗HIV病毒的活性。而且研究发现，许多从海藻中提取到的硫酸多糖如Nothogeniafastigiata、Aghardhiellatenra可以抑制HIV-1的吸附过程。而且海藻酸钠硫酸酯的抗病毒活性和其硫酸酯基取代位置及其取代度也有影响。另有少量研究报道，某些海藻酸钠硫酸酯有抗放射性抗辐射的功能，但目前人们对此研究相对较少。而且其抗辐射的机理也不很清楚。1.2.3海藻酸钠硫酸酯的应用及研究现状虽然研究表明海藻酸钠硫酸酯有诸如抗凝血、抗辐射和抗病毒的性质。而且很多研究表明，海藻酸钠硫酸酯作为药物制剂，其活性较小。但由于人们对海藻酸钠硫酸酯的研究起步时间相对较晚，而且对海藻酸钠硫酸酯的结构也不十分清楚，因此目前海藻酸钠硫酸酯在医药领域的应用并不广泛。主要如下，以海藻酸硫酸酯分散剂制成的PS型胃肠双重造影硫酸钡制剂，具有粘度低，粒度细，附壁性好，性能稳定等特点；\o"PSS"PSS是以海藻酸为原料研制的一种褐藻多糖双酯钠，具有抗凝血、降血脂和降低血液粘度的作用。海藻胶还可制作各种剂型的止血剂，包括止血海棉、止血纱布，止血薄膜，烫伤纱布，喷雾止血剂等。1.2.4海藻酸钠硫酸酯的制备方法目前海藻酸钠硫酸酯的制备方法有很多。如的制备仍存在一些问题：（1）在利用有机相法合成过程中会选用DMF、DMSO、吡啶、甲苯等有机溶剂作为反应介质，这些药品不但价格昂贵而且有较大的毒性；（2）无机相法合成硫酸酯所选用酯化剂一般都有很强的酸性、吸水性、脱水性及氧化性等，因此在反应过程中一般会伴随着多糖及其产物的水解；（3）合成过程中用到的各种有机溶剂在反应结束后，对产物的提纯带来很大的麻烦。鉴于以上问题，本研究课题拟用直接浓硫酸法。即用浓硫酸在不加任何介质溶剂的条件下直接和海藻酸钠进行反应。因为浓硫酸活性较强，这样既可使海藻酸钠酯化更完全减少副产物而且可以加快反应速率，而反应过程中不需要有机溶剂，因此产物更容易分离出来，而且产物的纯度也会较高。本实验没有有机溶剂也可以减少海藻酸钠在反应过程中的水解。另外，选用浓硫酸作为反应试剂也使成本大大降低。1.3本课题研究目的及意义包括天然的和合成的硫酸酯化多糖都与血液有很好的相容性。有的甚至表现出抗凝血活性。对多糖的羧基和羟基进行化学修饰可以是产物有很好的生物活性。对海藻酸钠进行硫酸酯化修饰后，产物就有了硫酸酯基和和羧基。这样的结构和天然的抗凝血物质—肝素有着最相似的结构。肝素早在50年前就开始被用作抗凝血治疗。以往的研究表明，天然的或经化学修饰的硫酸酯化多糖都表现出很好的抗凝血活性。这些活性都是因为硫酸酯基取代了葡萄糖残基而产生的。这些葡萄糖残基也正是肝素中硫酸酯基取代的关键部位。但是来自动物体内的肝素有诱发产生哺乳动物性禽流感和疯牛病的危险。因此，寻找新的抗凝血药物来代替肝素已经十分必要了。而海藻酸钠硫酸酯则可以作为一个良好的候选物。作为肝素的类似物，海藻酸钠硫酸酯目前在抗凝血方面的应用还很少。因此有着很大的开发前景。海藻酸钠硫酸酯的制备工艺不成熟是影响海藻酸钠硫酸酯广泛应用于药物制剂的一个很大的因素。本课题就针对海藻酸钠硫酸酯的制备工艺进行研究。本课题中，利用一种最简单的方法来制备海藻酸钠硫酸酯，即利用浓硫酸作为酯化试剂直接进行反应。反应产物用傅里叶红外光谱仪来表征其结构。并利用BaCl2-明胶分光光度法测定硫酸基的取代度。这部分实验是为后续实验研究海藻酸钠硫酸酯抗凝血研究做铺垫。2实验部分2.1实验试剂与仪器主要实验材料列于表2-1中。表2-1主要实验材料材料和试剂分子式规格供应商海藻酸钠(C6H7O8Na)n化学纯国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠NaOH分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司三氯乙酸Cl3CCOOH分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心无水乙醇C2H5OH分析纯天津市天力化学试剂有限公司浓硫酸H2SO4分析纯开封南大化工有限公司无水硫酸钠NaSO4分析纯天津市博迪化工有限公司氯化钡BaCl2·2H2O分析纯天津市大茂化学仪器供应站氯化钠NaCl分析纯天津市博迪化工有限公司明胶分析纯天津市德恩化学试剂有限公司pH试纸广泛上海三爱思试剂有限公司滤膜0.45μm上海迈坤化工有限公司主要实验仪器（装置）列于表2-2中。表2-2主要实验仪器仪器型号规格供应商电子天平FA2104N上海精密科学仪器有限公司集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发器RE-52AA上海亚荣生化仪器厂艾科浦C系列纯化水机AUP-3-150G-1颐洋企业发展有限公司傅立叶变换红外光谱仪FI-IR5700ThermoNicolet，USA紫外可见分光光度计UV765上海精密科学仪器有限公司石英玻璃皿751（10mm）江苏省宜兴市和桥石英玻璃器件厂真空干燥箱DZF-6050上海博讯实业有限公司医疗设备厂2.2海藻酸钠硫酸酯的制备及表征2.2.1海藻酸钠硫酸酯的制备用移液管量取适量98%的浓硫酸于三口烧瓶中，把三口烧瓶放于冰水浴中。用电子天平精确称量适量海藻酸钠，用微波炉小火干燥至恒重后，缓缓加入装有浓硫酸的三口烧瓶中。边加边搅拌。加完后，在冰水浴条件下搅拌反应3h。反应结束后向体系中加入适量浓NaOH溶液调节体系pH至碱性。把反应体系用蒸馏水透析24h，至透析液呈中性。透析后产物用无水乙醇进行醇沉，静置24小时，析出大量黄色沉淀后抽滤。抽滤、洗涤得黄色固体产物。改变海藻酸钠和浓硫酸的摩尔比，重复上述实验步骤，得到不同海藻酸钠和浓硫酸在比例下的产物。产物放在50℃的恒温干燥箱中干燥48h。得到块状产物。产物用研钵研磨成细小颗粒状置于干燥器皿中2.2.2海藻酸钠硫酸酯取代度的测定采用BaCl2-明胶分光光度法测定产物中硫酸酯基的取代度，通过强酸水解样品中释放出来的硫酸根，与氯化钡试剂反应生成硫酸钡沉淀，再用紫外分光光度法进行测定。具体方法为：标准曲线的绘制。准确称取干燥至恒重的硫酸钠于100ml容量瓶中，配成1mg/ml的溶液，用移液枪分别准确吸取30ul、60ul、90ul、120ul、150ul、180ul加去离子水稀释至200ul，加入5.00%的三氯乙酸溶液3.8ml，摇匀，加入氯化钡—明胶溶液1ml，振荡摇匀后静置15分钟。将上述不同浓度的标准溶液样组分别加入到石英比色皿中，另以200ul去离子水作为空白样，用紫外分光光度计于360nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，即可绘制标准曲线。样品测定：用电子天平精确称取一定量研磨碎的样品，以10mL浓度为1mol/L的HCl溶液作溶剂，密闭烧杯，置于100℃的油浴锅中加热水解6~8h，水解结束后在室温下冷却，后再取0.2mL进行分析，其余操作同标准曲线的制备过程，每个样品至少平行测定3次，取平均值，根据所绘制的标准曲线即可计算出样品中硫酸根的含量。样品中硫元素的含量可用如下公式计算：式中：1/3为硫酸根中硫元素所占的比例，200为所取试样的体积数。硫酸基取代度的计算公式为：DS=1.98S%/(32-1.02S%)。式中：DS—为硫酸基取代度；S—为硫元素的质量分数（由硫酸根含量折算而得），百分含量。2.3红外表征把干燥后碾碎的产物与KBr混合压片。用傅里叶转换红外光谱仪来测定产物的红外吸收光谱。2.4海藻酸钠硫酸酯制备的因素考察2.4.1投料比海藻酸钠硫酸酯取代度的影响分别以海藻酸钠与浓硫酸的摩尔比（海藻酸钠以其葡萄糖单元的摩尔数计算）为1：3，1：4，1：5，1：6来制备海藻酸钠硫酸酯。通过测定海藻酸钠硫酸酯中硫酸酯基的取代度来确定最佳投料比。2.4.2反应时间对海藻酸钠硫酸酯制备的影响分别以相同的投料比进行不同时间的反应。反应时间分别为2h，3h，4h，5h。通过测定不同反应时间下海藻酸钠硫酸酯中硫酸酯基取代度和海藻酸钠硫酸酯的产率来确定最佳反应时间。2.4.3反应温度对海藻酸钠硫酸酯制备的影响实验过程中，分别用浓硫酸和海藻酸钠在不同温度的条件下进行反应。通过测量产物的取代度，以及所获得产物的纯度来得到海藻酸钠硫酸酯的取代度和反应温度之间的关系。3结果与讨论3.1海藻酸钠硫酸酯的红外光谱图谱图3-1海藻酸钠（SA）与海藻酸钠硫酸酯（SAS）的红外图谱上图显示的是取代度为0.583的海藻酸钠硫酸酯和海藻酸钠的红外光谱图。与海藻酸钠(SA)相比，海藻酸钠硫酸酯(SAS)图谱上新增了两处特征吸收峰。一处是在1230cm=-1\*Arabic-1处，这一吸收峰表明的是S=O键的不对称伸缩振动。另外一处是在858cm=-1\*Arabic-1处，这一吸收峰标明的是与C-O-SO3基团直接相连的C-O-S键的对称伸缩振动。说明海藻酸钠成功接入了硫酸酯基。因为取代度比较低，所以这两个峰都不是很强。而且受到其它基团的影响，海藻酸钠硫酸酯的红外图谱上有很多不明显的指纹吸收峰。3.2海藻酸钠硫酸酯的取代度3.2.1硫酸钡标准曲线表3-1不同浓度标准溶液的吸光度SO42-浓度30（ug）60（ug）90（ug）120（ug）150（ug）180（ug）吸光度0.1190.2080.2580.2860.3990.539吸光度0.1200.2100.2580.2850.3970.544吸光度0.1200.2100.2550.2800.3970.545平均吸光度0.1190.2090.2570.2840.3980.543根据表3-1可绘制出如图3-2的硫酸钡标准曲线。图3-2硫酸根吸光度标准曲线3.2.2海藻酸钠硫酸酯的取代度所得数据如表3-2所示。表3-2投料比与取代度关系投料比(H2SO4:SA)A（平均值）SO42-S%DS30．15952．748．790．75640．13443．487．250．58350．15149．788．30．6985．430．15952．748．790．75660．22777．9212．991．372取代度与投料比的关系可以由图3-3看出。图3-3投料比对海藻酸钠硫酸酯取代度的影响3．3制备海藻酸钠硫酸酯的最优反应条件3.3.1硫酸酯化试剂和海藻酸钠的比例对取代度的影响硫酸酯化试剂和海藻酸钠硫酸酯的比例对海藻酸钠硫酸酯取代度的有很大影响。硫酸酯化试剂和海藻酸钠的比例可以通过浓硫酸的摩尔量与海藻酸钠中葡萄糖单元的摩尔比来描述。从图3-3可以看出，当浓硫酸与海藻酸钠的比例由3:1上升到6:1的过程中，海藻酸钠硫酸酯的取代度呈上升趋势。当该比例为6:1时，取代度达到最大值1.38。由此可见浓硫酸与海藻酸钠的比例越大取代度就越高。虽然由图中可知，海藻酸钠硫酸酯的取代度随浓硫酸与海藻酸钠的比例的升高而升高，但是，该比例不可能无限加大。原因有两点。第一，海藻酸钠中每个葡萄糖单元上只有两个可以被取代的羟基，这就是说海藻酸钠硫酸酯的取代度最大为2。所以当取代度接近2时，增加浓硫酸与海藻酸钠的比例并不会使得取代度提高很多。而且，浓硫酸的量如果过多，则会导致未参与反应的浓硫酸的比例大幅增加。这样浪费了大量的浓硫酸，不仅没有明显提高取代度，还会导致污染等问题。其次，海藻酸钠硫酸酯中的硫酸酯基和羟基之间存在空间位阻效应和静电排斥作用，所以海藻酸钠硫酸酯中没有被酯化的羟基很难再被酯化。考虑两个方面的因素，浓硫酸和海藻酸钠的最优投料比应该在6:1到7:1之间。3.3.1反应时间对海藻酸钠硫酸酯制备的影响实验过程中发现，反应时间对海藻酸钠和浓硫酸的反应程度有很大影响。具体表现为：当反应体系在冰水浴中时，在搅拌的前30分钟，海藻酸钠一直保持晶体颗粒状。当反应一个小时左右时，海藻酸钠和浓硫酸的混合物开始呈糊状。体系颜色也有本身的浅黄色逐渐变成灰褐色。体系的粘稠度也慢慢加大。当反应超过四个小时时，反应体系的颜色，粘稠度基本保持不变。由此可以看出，海藻酸钠和浓硫酸反应的最佳时间是4小时。以上现象可以解释如下：海藻酸钠晶体结构紧密，与浓硫酸混合时，其与浓硫酸的接触面积很小，因此刚开始反应速度很慢，所以开始时反应体系几乎不呈现变化。随着反应时间的延长，海藻酸钠在浓硫酸和搅拌的共同作用下逐渐由晶体状态变成无定形态，此时浓硫酸和海藻酸钠的接触面积变大，活化中心形成，引发反应。这一过程需要很长时间。另外，酯化反应是一个可逆反应，因此酯化反应本身也需要较长时间。当反应时间达到四小时左右时，反应达到一个动态平衡状态。此时，延长反应时间将对海藻酸钠硫酸酯的取代度没有更多提高。另外，因为浓硫酸有较强的氧化性和脱水性。在反应过程中，海藻酸钠不仅与浓硫酸发生酯化反应，还会伴随有脱水和水解等副反应。考虑以上情况，最佳的反应时间应该是4小时。3.3.1反应温度对海藻酸钠硫酸酯制备的影响实验过程中，当反应温度比较高时（即在常温下），反应比较剧烈。反应体系的颜色很快发生变化，而且体系粘度也很快增大。而在该条件下反应所得的产物进行醇沉时，所得产物很少。而且进行取代度测定时，取代度也很低。但当把反应体系置于冰水浴中进行反应时。反应时间有所加长。但进行取代度测定时，取代度比较理想。以上情况的出现可以从以下几方面来解释。首先，浓硫酸与海藻酸钠的反应是放热反应，高温将不利于反应的正向进行。所以高温下进行的反应会使产物的取代度比较低。其次，浓硫酸的反应活性很高，而且有较强的氧化性和脱水性。而且浓硫酸的氧化性和脱水性随着温度的升高而增强。因此在高温下进行反应时，副反应比较多。所以对反应后产物进行醇沉时，得到海藻酸钠硫酸酯的量很少。虽然低温有利于反应向正反应方向进行，但是如果温度过低，又会使得反应速率很慢，这样将不利于反应平衡的形成。另外，温度过低，所需要的条件也很难达到。因此综合以上几方面的因素，最佳的反应温度为0℃4结论本文通过直接浓硫酸法来制备海藻酸钠硫酸酯，用傅里叶变换红外光谱仪对产物进行了结构表征，并用氯化钡—明胶法测定所得产物中硫酸酯基的取代度。并对影响海藻酸钠硫酸酯制备的各种因素进行了讨论。实验结果表明：直接浓硫酸法能够将硫酸根以硫酸酯基的形式接到海藻酸钠中；在反应过程中，体系温度、浓硫酸与海藻酸钠的投料比、酸碱度、反应时间均对产物的纯度和产物的硫酸酯基取代度有影响。对各种影响因素进行综合分析后发现，在冰水浴中，浓硫酸与海藻酸钠的投料比为6：1，反应时间为3h时，所得产物产率较高，而且产物的取代度也比较理想。参考文献田庚元．天然多糖的研究和应用上[J]．上海化工，2000，10：29–31．魏金婷，刘文奇．天然活性多糖研究现状[J]．莆田学院学报，2004，11(3)：20–23．王兆梅，李琳，郭祀远，等．多糖结构修饰研究进展[J]．中国医药杂志，2002，33(12)：616–620．李玉华，王凤山，贺艳丽．多糖化学修饰方法研究概况[J]．中国生化药物杂志，2007，28(1)：62–65．贺珍俊．多糖分子修饰语抗凝血活性[D]．内蒙古大学硕士学位论文，2004．徐文清．硫酸酯化多糖研究新进展[J]．天津药学，2002，14(006)：1–4．何智健，陈建伟，李祥．多糖的硫酸酯化研究探要[J]．中医药学刊，2003，12(21)：2087–2088．DoctorVM，LewisD，ColemanM，etal．Anticoagulantpropertiesofsemisynthesizedpolysaccharidesulfates[J]．ThrombRes，1991．64：310–317．LihongFan，LanJiang，YongmeiXu，etal．Synthesisandanticoagu