生物制品生产的基本技

生物制品生产的基本技第一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日第一节菌(毒、虫)种的选育培养与保藏

一、生物制品菌(毒、虫)种的分类生物制品中使用的菌(毒、虫)种的范围很广泛，包括生产和检定疫苗、毒素、类毒素、抗血清以及诊断用品等的菌(毒、虫)种，并随着生物制品种类的增多和生物制品技术的发展，菌(毒、虫)种的内容也会不断增加。第二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（一）、按菌(毒、虫)种的毒力分类1、强毒菌(毒、虫)种

是指具有强大致病力的菌(毒、虫)种，一般免疫原性也良好，常用于制造某些灭活疫苗，抗血清以及疫苗效力检验。2、弱毒菌(毒、虫)种

是指对动物无致病力而具有一定免疫原性的菌(毒、虫)种，主要用于制造弱毒活苗。第三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（二）、按菌(毒、虫)种的用途分类1、生产用菌(毒、虫)种

是指用于生产生物制品的菌(毒、虫)种，即指生产疫苗、抗毒素、类毒素、抗血清及诊断用品的菌、毒种。如生产猪瘟兔化弱毒疫苗用的猪瘟种毒，生产破伤风类毒素的破伤风菌种，生产炭疽抗血清的Ⅱ号炭疽杆菌C40～22菌种，制造牛型结核菌素的牛型结核杆菌菌种等．第四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日2、检定用菌(毒、虫）种

是指用于检定生物制品效力等菌(毒、虫)种。如效力检验中攻毒用的新城疫强毒，猪丹毒强毒菌种等。另外，还包括用于检定诊断血清交叉反应的菌（毒、虫）种。3、工具用菌（毒、虫）种是指在生物制品生产中作为工具使用的菌（毒、虫）种。如基因工程中表达某些异种抗原用的宿主大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等。（二）、按菌(毒、虫)种的用途分类第五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（一）、具有良好的免疫原性由于生物制品主要是免疫制剂，故耍求菌(毒、虫)种应具有良好的免疫原性，使用后能产生坚强的体液免疫和细胞免疫，并持续较长时间，同时对某些菌(毒，虫)种而言还应是抗原谱广。一般来说，动物接种后产生80％以上的保护即为有良好的免疫原性。因为机体的免疫反应是一个生物学过程，受到遗传、环境等许多因素的影响，不论使用菌(毒、虫)种的免疫原性多么好，都不可能一次使免疫动物获得100％的保护。生物诊断用品的菌(毒、虫)种应以少量注入动物体内就能产生强烈免疫反应，这样才能生产出既特异又灵敏的诊断用品。

二、生物制品中菌(毒、虫)种的条件第六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（二）、具有可靠的安全性生物制品使用的菌(毒、虫)种除具有良好的免疫原性外还应安全。菌(毒、虫）种的安全性主要与两方面的因素有关，一方面是菌(毒、虫)种本身的残余毒力；另一方面是混有强毒或其他病原体。

残余毒力是指减毒后的弱毒菌(毒、虫)种仍残存一定的毒力或致病力。如鸡新城疫Ⅰ系弱毒疫苗种毒就保持较强的毒力，对雏鸡接种后有致病性，而2个月龄以上的鸡接种才安全。第七页，共三十八页，编辑于2023年，星期日在菌(毒、虫)种的选育培养时，尽量降低毒力，保持良好的抗原性，使动物接种后既能产生良好的免疫，又不致于引起发病或损伤。而在实践中，一般免疫原性与毒力呈正相关，免疫原性强毒力也强。如果采用某种方法使毒力降低，免疫原性也随之降低。用于生产灭活疫苗的强毒都有很好免疫原性，而用于生产活疫苗的弱毒，免疫原性都有一定程度下降。这是选育培养菌(毒、虫)种时需要注意和解决的一个矛盾，从某种意义上讲安全更为重要。（二）、具有可靠的安全性第八页，共三十八页，编辑于2023年，星期日在菌(毒、虫)种的选育培养过程中还要避免污染强毒和其他病原体，尤其是用于活疫苗生产的菌(毒、虫)种。因为在生产活疫苗时，不加任何灭活剂，使污染的强毒和病原体得不到应有的处理。对于毒种来说，控制污染外源病原体是较难的。因为用于病毒培养的细胞、鸡胚及动物不易做到完全无污染。（二）、具有可靠的安全性第九页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（三）、具有典型的生物学性状选育培养的菌(毒、虫)种要有典型的生物学性状，如形态、染色、培养特性、生化特性、抗原结构、致病性、宿主适应范围、代谢产物、色素产生以及抵抗力等。这些生物学性状是鉴别菌(毒、虫)种的重要标志，可用以区分其他微生物，进而在生产和检定生物制品时依据这些性状来控制质量。如果发现某些性状改变就标志着菌(毒、虫)种发生了变异或发生外源污染，应及时废弃或更换，如果是用弱毒或无毒菌(毒、虫)种生产生物制品，这些性状也是区别强毒株的标志，从而保证制品的安全性和免疫原性。第十页，共三十八页，编辑于2023年，星期日微生物在传代和生产过程中，由于大量增殖时基因突变而表现出某些特性变异。如形态、生化特性、毒力、抗原性及药物敏感性的变异。人工选育培养弱毒菌（毒、虫)株就是利用毒力变异的特性在一定条件下经多次传代而使毒力减弱的。然而，选育出的菌(毒、虫)种在用于生产时要注意具有稳定的遗传特性和保持微生物群体的一致性，尤其是毒力和免疫原性的遗传稳定性，以避免毒力返祖和免疫原性下降，从而确保生物制品的质量。（三）、具有典型的生物学性状第十一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（四）、具有遗传稳定性和一致性一般采用限制菌(毒、虫)种的传代次数和培养条件来控制变异幅度，并定期进行检定。发现有性状变化时可通过育种、传代、蚀斑纯化等方法来恢复性状；如果在微生物群体中发现性状不一致，可采用传代和筛选等方法进行纯化，例如，细菌可挑选典型的单个菌落，病毒可挑选蚀斑进行纯化。菌(毒、虫)种在遗传上的稳定性和一致性对生产至关重要。第十二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（五）、历史及有关资料清楚完整对于菌(毒、虫)种要有明确的来源，分离时动物病情及流行情况，传代及生物学和免疫学特性，生产工艺质量检定，动物试验等各方面的研究资料和数据都应完整。这样的菌(毒、虫)种方可用于生物制品。第十三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日生物制品用的菌(毒、虫)种还应该易于培养和大量繁殖，并能稳定地达到和保持较高的滴度。用于生产类毒素和抗毒素的菌种，应该能够大量产生外毒素。对于某些生物制品还应考虑提取、纯化手段等。（六）、其他条件第十四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日三、菌(毒、虫)种的选育培养方法按着菌(毒、虫)种的标准选育培养优良的菌(毒、虫)种是生物制品研究和生产的关键。选育培养方法一般有如下几种。第十五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（一）、自然选育培养法人们对生物制品菌(毒、虫)种的选育培养最先采用的方法就属于自然选育培养法。远在15世纪，我国民间就用良好的天花患者的干燥痂皮研成粉末吹鼻免疫。100多年前，巴斯德就选用鸡霍乱巴氏杆菌陈旧培养物制备疫苗，并获得免疫成功。此后又有学者采用加热杀死鸡霍乱巴氏杆菌首次制成了死菌疫苗。自然选育培养法是对自然界中已存在的菌(毒、虫)株进行分离，从中选择适于种用的菌(毒、虫)株。一般常以感染的动物，媒介昆虫以及污染物等获得分离。三、菌(毒、虫)种的选育培养方法第十六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日分离到菌(毒、虫)株的毒力，抗原性往往都不同。某些自然分离的菌(毒、虫)株毒力很强，如自然分离的多杀性巴氏杆菌等。这些强毒株适于制造灭活菌、诊断抗原和检定用。有些自然分离菌(毒、虫)株毒力很弱，抗原性也较好，如鸡新城疫Bl株弱疫苗，L系弱毒、马立克氏病SB-l弱毒株等，这些弱毒株适于制造弱疫苗。在自然弱毒中还包括由异种动物引用过来的菌(毒、虫)株，如用火鸡疱疹病毒预防鸡马立克氏病、鸽痘病毒预防鸡痘，也有用牛病毒性腹泻-粘膜病弱毒株预防猪瘟等。这些菌(毒、虫)株是由于在自然条件下流行或传代过程中适应存在和变异的结果。（一）、自然选育培养法第十七页，共三十八页，编辑于2023年，星期日自然选育培养菌(毒、虫)种时，首先从分离的菌(毒、虫)株中选择形态特征、培养特性、理化特性典型的，并与相应诊断血清出现明显血清学反应的菌(毒、虫)株，然后再测定其毒力和免疫原性。测定时首先用实验动物进行初选，然后再用原宿主动物测定。毒力测定一般是先选用敏感的实验动物，鸡胚或细胞培养物等，测定菌(毒、虫)株的半数致死量（LD50），最小致死量（MLD），半数感染量（ID50）或者是半数鸡胚致死量（CELD50

），半数鸡胚感染量（CEID50

）、半数细胞感染量（TCID50

）等。（一）、自然选育培养法第十八页，共三十八页，编辑于2023年，星期日在测定时，还应设生理盐水或培养液阴性对照和同种菌(毒、虫)种的阴性对照，以免得出错误结论。如果阴性对照动物发病，则实验不能成立；如果阴性对照不发病，则对结论应慎重。免疫原性测定是使对菌(毒、虫)种免疫敏感的动物产生免疫力，然后再用强毒攻击，如果动物不发病死亡则表明有一定的免疫原性。如果分离的菌(毒、虫)株有数种，可分别免疫，然后交叉攻击感染以确定抗原谱。作为菌(毒、虫)种应选用的免疫原性好，且抗原谱广，能提供交叉保护的菌(毒，虫)株。（一）、自然选育培养法第十九页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（二）、人工选育培养法由于死疫苗免疫效果不理想，而且反应重，这便促使人们研究和使用弱毒活疫苗免疫。生产弱毒活疫苗所用的菌(毒、虫)种只靠自然选育培养是远不能满足要求的，因而开始了人工选育培养菌(毒、虫)种。目前，在生产中用于制造疫苗菌(毒、虫)种多为人工选育培养获得。本法是生物制品菌(毒、虫)种选育培养的最重要、最常用的方法。

第二十页，共三十八页，编辑于2023年，星期日人工选育培养法就是分离的菌(毒、虫)株在培养和传代过程中采用某些理化和生物学方法诱发其发生变异，使毒力减弱或消失而仍保持一定的免疫原性。有的毒力致弱后毒力稳定，用于制苗的代数不受限制；也有的在继代时免疫性亦随之丧失，制苗使用代数较窄。入选的微生物要经过毒力和免疫原性稳定性测定，在培养基中连续传代后不改变的，说明稳定性良好且有使用价值。人工选育培养菌(毒、虫)种可具体分以下几种方法。（二）、人工选育培养法第二十一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日1、物理学方法主要包括以下几个方面。（1）温度各种微生物都有其最适宜的生长繁殖温度，如果改变温度可引起发生变异，以适应环境。再通过选择生产性能比较稳定的变异株，如巴斯德将炭疽杆菌培养于42℃育成减毒株，用于预防注射；猪肺疫内蒙古系弱毒株也是经高温培养选育的。（二）、人工选育培养法第二十二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（2）射线将微生物暴露于紫外线或χ射线、γ射线下，大大增强了微生物的突变频率，可从中选出变异株。如制造乙型脑炎疫苗的2-8弱毒株就是采用紫外线处理和小鼠皮下传代选育的。仔猪副寒C500号菌株选育过程中就使用了钴γ射线处理。（二）、人工选育培养法第二十三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日2、化学方法主要包括以下几个方面。（1）改变培养时的气体环境需氧菌培养在厌氧环境中，或厌氧菌培养在有氧环境中，也能够逐渐适应，产生变异株。如Stern在二氧化碳环境中选育出了无荚膜的炭疽杆菌变异株，。（二）、人工选育培养法第二十四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（2）改变培养基的组成在细菌培养基中加入或去掉其中物质可以引起变异，并使毒力下降，成为弱毒株。如马流产C355弱毒株是在培养基中加入了醋酸铊育成的；猪肺疫630弱毒株是在含海欧牌洗涤剂培养基中连续传代育成的；猪丹毒G4T10弱毒株是在含维黄素的血琼脂上培养选育的；Williams应用亚硝酸和羟胺诱变选育了腺病毒株。能够引起变异的化学物质种类很多，除上述外还包括许多碱基化合物、烷基化合物以及吖啶类。第二十五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日3、生物学方法主要包括以下几个方面。（1）通过动物机体将强毒菌(毒、虫)株通过非易感的动物机体，可以改变强毒株的毒力，使其成为弱毒株。如将猪瘟强毒通过兔体传代使其成为猪瘟兔化弱毒用于疫苗生产，已在世界享有盛誉；通过鹌鹑成功地培育了鸡痘鹌鹑化弱毒；通过豚鼠成功地培育了布氏杆菌羊五号弱毒株；通过乳兔成功地培养了猪地方性肺炎乳兔化弱毒株等。也可以通过鸡胚培育弱毒株，如鸡胚致弱的羊痘鸡胚化弱毒。（2）通过细胞培养物将强毒力菌(毒、虫)株通过细胞培养物反复传代也可以使其毒力减弱或消失。如马传染性贫血驴白细胞弱毒株，山羊痘细胞弱毒株，通过猪肾细胞继代的伪狂犬病弱毒株等。通过上述方法人工选育培养的菌(毒、虫)种，其形态、生理生化特性可能也会随之改变，但最重要的是要保证遗传上稳定的弱的毒力和有良好的免疫原性。第二十六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（三）、基因重组选育培养法基因重组技术选育培养菌(毒、虫)种是上世纪80年代发展起来的一项新技术，是将编码保护性抗原的目的基因导入载体中，使之得到表达，产生大量保护性抗原蛋白，并可用作疫苗。用这种方法生产的疫苗称为基因工程疫苗。目前用这种方法选育和研制成功的有大肠杆菌K88、K99重组菌株，用大肠杆菌表达口蹄疫抗原，在牛痘病中表达狂犬病病毒的表面糖蛋白等。这一技术的建立和发展，不仅能够把各种微生物的基因进行如愿重组，使没有可用疫苗或虽有疫苗而在生产上存在很大困难的疾病的免疫预防得到可能的解决，而且将有许多更安全有效的重组基因工程疫苗代替常规疫苗制品。这一技术将为疫苗研制开辟广阔的前景。第二十七页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（四）、菌（毒、虫）种的保藏微生物一旦被入选为种子，应立即冻干并保存。冻干后的细菌于4℃的条件下保存；冻干后的病毒在低于-20℃的条件下保存。这样可以保存多年而形状不改变。为避免污染动物内源性细菌和病毒，入选的菌（毒、虫）种不应再通过动物体传代。如果通过动物体传代，分离物必须按照新的菌（毒、虫）种对待进行全部测定，证明可以使用后，保存备用。保存的菌（毒、虫）种使用时，传代后应测定其理化性状、毒力和免疫原性，符合标准者方可使用。第二十八页，共三十八页，编辑于2023年，星期日第二节、生物制品的灭活剂与保护剂

一、灭活与灭活剂InactivationandInactivator凡破坏微生物的生物学活性及血清中补体活性，或破坏病原微生物的繁殖能力和致病作用，均称之为“灭活”。适当的灭活剂和灭活方法，对微生物抗原性及免疫原性没有影响。研究灭活生物制品，重要条件是选择适当的灭活剂和灭活方法。第二十九页，共三十八页，编辑于2023年，星期日一、灭活与灭活剂（一）、物理学方法灭活一般常用加热杀菌、超声波裂解细胞、射线照射杀死微生物体或消除其毒性。采用此类灭活方法应注意，加热处理以放水浴间接升温为好；超声波裂解应放冰浴中间断进行；60Co照射处理，应根据被照射物的容量大小选择照射物与钴源的距离和剂量。第三十页，共三十八页，编辑于2023年，星期日据试验用l0000mL大玻瓶装6000mL的血清或血液，当吸收60Co量达200万rad/时能完全杀死芽孢杆菌，150万rad/时可使非芽孢菌完全灭活。照射后的血清或裂解红细胞全血的质量不受影响，经测定17种氨基酸含量与非照射的血清无差异。对病毒的灭活试验结果为：含鸡新城疫病毒的鸡胚尿囊液，吸收60Co剂量达50万rad/时完全灭活，猪瘟病毒强毒吸收量达到300万rad/时完全失去致病力。被60Co照射处理的血清，用于细胞培养与未照射的血清均产毒效果良好；被照射处理的裂解全血，不影响牛出败菌及禽霍乱菌的生长，制出的菌苗效力良好。一、灭活与灭活剂第三十一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（二）、化学药剂灭活

制备生物制品，在20世纪初Lowenstein和Eisler（1911）就开始用甲醛减毒制备破伤风类毒素；1924年Puntoni以0.1％甲醛或0.1％苯酚制成犬瘟热疫苗；1925年CastaBoyer和Plaudi等用甲醛灭活制备猪丹毒菌苗等。随后许多学者还试用氯仿、甲苯、胺叶油等灭活剂制牛瘟脏器苗。到了20世纪的30年代，Dorset等用结晶紫制猪瘟疫苗成功。第三十二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日数十年来，除主要用甲醛灭活剂外，在生产口蹄疫灭活苗过程中，不断选出了新的灭活剂，如1957年Ubetini等报道用β-丙酰内脂；1959年Franklin和Welkei等试用羟胺；1964年Martinsen用缩水甘油醛等。但是，无论选用何种灭活剂，都应注意以较低温度和最低剂量为原则，同时应注意溶液的pH值，以近于中性为宜。此外被灭液的浓度如含菌或含蛋白量高，应适当增加灭活剂剂量或适当稀释灭活剂，否则易造成灭活不完全。第三十三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日有些灭活剂还需在灭活一定时间后，加灭活作用阻断剂，以免继续灭活而损害抗原性。总之，化学灭活剂的灭活作用，一般是随剂量增大，温度升高，灭活效率递增。灭活剂量大小与灭活时间成反比。并且在选用灭活剂时，应以能保证疫苗安全与效力，以低剂量和较低温度短时间处理为好。第三十四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日（三）、影响灭活剂灭活的因素1、