第五章酶的固定化

第五章酶的固定化第一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一第一节概述第二节固定化酶的性质及其影响因素第三节固定化酶的制备第四节固定化细胞第五节固定化辅酶和原生质体第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用主要内容第二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一第一节概述什么是酶？催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。第三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一游离酶的缺陷：大多数游离酶的稳定性比较差；游离酶的使用成本较高；一些游离酶存在自水解作用；产物的分离提纯困难。第四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一固定化酶的发展史

在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主1953年，GrubhogerSchleith用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术。第五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一

1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化酶技术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定化天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化酶应用的局面。1971年，第一次国际酶工程会议在美国召开，会议主题是固定化酶的研制和应用,确定固定化酶（ImmobilizedEnzyme）统一名称第六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸固定化死菌体固定化细胞固定化植物细胞固定化原生质体1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精

1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功

1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸第七页，共七十五页，编辑于2023年，星期一什么是固定化酶？固定化酶（ImmobilizedEnzyme）：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用水溶性酶水不容性的载体固定化酶固定化技术第八页，共七十五页，编辑于2023年，星期一固定化酶制备原则（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；（3）应有最小的空间位阻；（4）酶与载体必须结合牢固；（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；（6）成本要低。第九页，共七十五页，编辑于2023年，星期一长时间使用，在绝大多数情况下提高了酶的稳定性，有利用工艺的连续化和管道化酶的使用效率提高，适合于多酶反应酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化极易将固定化酶与底物、产物分开1234优点固定化酶的优点第十页，共七十五页，编辑于2023年，星期一固定化酶的缺点增加了固定化的成本，使工厂开始投资大只能用于可溶性的底物和小分子底物，对大分子底物不适宜酶固定化时酶的活力有所损失.第十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一多次使用可以装塔连续反应优点：纯化简单提高产物质量应用范围广缺点：首次投入成本高大分子底物较困难固定化酶的优缺点：第十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一第二节固定化酶的性质及其影响因素一、影响固定化酶性质的因素二、固定化后酶性质的变化三、评价固定化酶的指标第十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一一、影响固定化酶性质的因素1、酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。第十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一一、影响固定化酶性质的因素2、载体的影响（1）构象效应（2）空间屏蔽效应第十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（3）微扰效应（4）分配效应：载体与底物带相同电荷-底物少；反之则多。第十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（5）扩散限制效应

外扩散限制内扩散限制第十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期一二、固定化后酶性质的变化1、固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降原因：酶结构的变化空间位阻第十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期一二、固定化酶的性质固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高。（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。

(3)对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。(4)对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高。第十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期一2、固定化后酶稳定性提高的原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。第二十页，共七十五页，编辑于2023年，星期一3、pH的变化pH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。第二十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一pH对固定化酶的影响：1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动;载体带正电荷，pH向酸性方向移动。

第二十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一3、pH的变化

2）产物性质对体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低第二十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一4、最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5、底物特异性变化

作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。第二十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化（1）载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km‘<Km第二十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一三．评价固定化酶的指标：1、酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。1Kat=1mol/s=60mol/min=60*106umol/min=6*106IU2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位

第二十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一三、评价固定化酶的指标：3、4、

酶结合效率，又称为酶结合率，是指酶与载体结合的百分率。

酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。第二十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期一5、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。6、固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作的时间。第二十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期一四、固定化酶的活力测定方法介绍1、间歇测定：在搅拌或震荡反应中，在与溶液酶相同测定条件下进行，然后间隔一段时间取样，过滤后按常规方法测定产物生成量或底物的消耗量。此法操作简单。第二十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期一四、固定化酶的活力测定方法介绍2、连续测定法利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。

第三十页，共七十五页，编辑于2023年，星期一总结：固定化酶的性质及其影响因素提要影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标酶本身的变化载体的影响固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同米氏常数Km的变化评价指标活力测定方法第三十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一第三节固定化酶的制备一、一般方法及特点二、酶的固定化方法第三十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一一、一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1．四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）

第三十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一2、选择方法依据：

（1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择第三十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一3、固定化后酶的考察项目：（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。（2）考察固定化酶稳定性。（3）考察固定化酶最适反应条件。第三十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一二、酶的固定化方法（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法（entrappingmethod）第三十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（一）吸附法应用实例1：固定化乳糖酶-连续生产低乳糖奶乳糖不耐症固定化乳糖酶奶子糖粳米粥第三十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期一利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶第三十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期一应用实例2：污水的生物净化第三十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期一

吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。

选择载体的原则：（1）要有巨大的比表面积；（2）要有活泼的表面；（3）便于装柱进行连续反应。第四十页，共七十五页，编辑于2023年，星期一活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。

优点：操作简单、条件温和、载体廉价易得、可反复使用。缺点：结合力不劳、容易脱落。第四十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（二）结合法应用实例：生活中的酶电极：血糖试纸第四十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一酶电极：特点：快速、方便、灵敏、精确范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。第四十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一1、离子键结合法2、共价键结合法☆选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。第四十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（1）离子结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶

……++++++++++++----------------++++++++第四十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一2、共价键结合法（1）概念：酶分子与载体之间以共价键作用而实现结合的固定化方法。（2）可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体第四十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一共价键结合法制备固定化酶的“通式”首先载体上引进活泼基团关键然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键第四十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（4）载体活化的方法：A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法第四十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期一A、重氮法反应示意式如下：第四十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期一A、重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基第五十页，共七十五页，编辑于2023年，星期一B、叠氮法例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：（1）酯化（2）肼解（3）叠氮化

（4）偶联第五十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一B、叠氮法对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物，最后与酶偶联。第五十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一C、烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。第五十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一D、硅烷化法（APTS氨化法）用于含有羟基载体的活化，可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些中间分子进一步和酶分子发生连接反应。一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。第五十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一E、溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。第五十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一E、溴化氰法第五十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一应用实例：白色污染的消除

（三）交联法第五十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期一交联法是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间交联的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。常选用的惰性蛋白主要有牛血清白蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原以及血红蛋白等。第五十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（三）交联法常用试剂常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)，而使蛋白发生交联。酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构第五十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（三）交联法的形式交联法有2种形式

酶直接交联法酶辅助蛋白交联法第六十页，共七十五页，编辑于2023年，星期一1、酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但固定化过程条件控制相对比较困难、制备的固定化酶活力回收率相对较低、形成的固定化酶机械强度不足。第六十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期一2、酶辅助蛋白交联（共交联法）为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。第六十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期一注意与共价结合法的区别活化方法基本相同；共价结合法：载体首先活化，然后除去游离的多功能试剂后再加入酶与载体共价偶联；共交联法是将酶和载体以及交联剂同时加入到同一反应体系中实现共价偶联。第六十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期一应用实例1：固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。（四）包埋法（entrappingmethod）

第六十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期一应用实例2：制造人工肾：利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。第六十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（四）包埋法（entrappingmethod）

定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。第六十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期一（四）包埋法