第四节胚胎干细胞培养与应用

细胞是机体组成的基本单位细胞细胞群组织机体小飞守角制作当前第1页\共有52页\编于星期六\9点1.干细胞的概念：是指动物（包括人）早期胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。即未分化或未完全的种子细胞。干细胞（Stemcell）又叫起源细胞。2.干细胞作用：是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的种子细胞。一、干细胞小飞守角制作当前第2页\共有52页\编于星期六\9点专能干细胞多能干细胞全能干细胞按分化潜能按发育状态胚胎干细胞成体干细胞3、干细胞的分类小飞守角制作当前第3页\共有52页\编于星期六\9点专能干细胞：（multipotentstemcell）只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。全能干细胞：（Totipotentstemcell）具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（ES细胞）多能干细胞：（pluripotentstemcell）具有分化出多种组织细胞，但有失去发育为个体的潜能。如造血干细胞、神经干细胞。小飞守角制作当前第4页\共有52页\编于星期六\9点成体干细胞

成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。小飞守角制作当前第5页\共有52页\编于星期六\9点造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。造血干细胞小飞守角制作当前第6页\共有52页\编于星期六\9点造血干细胞分化小飞守角制作当前第7页\共有52页\编于星期六\9点骨髓；外周血；脐带血；胎儿造血系统；胚胎干细胞。造血干细胞的来源造血干细胞的移植：1、采集供体者的造血干细胞（骨髓、外周血、脐带血），并与受体进行HLA配型；2、适度抑制受体免疫系统。小飞守角制作当前第8页\共有52页\编于星期六\9点成人细胞或脐血(骨髓和血)/胎儿组织(专能/多能)。人工流产后的人类胎儿生殖组织(全能)。通过体外授精产生的人类胚胎，治疗不育症的夫妇不再需要(全能)。用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎(全能)。女性供卵要非常慎重。通过体细胞核转移技术(克隆技术)产生的人类胚胎(全能)。以上都必须获得当事人的知情同意。4、干细胞的来源小飞守角制作当前第9页\共有52页\编于星期六\9点1.概念：简称ES或EK细胞,是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的未分化状态的一类细胞.2.特点：（1）形态:体积小、细胞核大、核仁明显。（2）功能:具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。（3）在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。二、胚胎干细胞小飞守角制作当前第10页\共有52页\编于星期六\9点3、来源：早期胚胎囊胚的内细胞团小飞守角制作当前第11页\共有52页\编于星期六\9点特点：具有增殖能力并保持未分化状态、在一定条件下可以向各种组织和器官分化、易于进行基因改造等。内细胞团：内细胞团（未分化的细胞）具有很强的分化能力，可以进一步分裂、分化，形成组织和器官，再逐步发育成个体。这些细胞被认为具有全能性，称为胚胎干细胞。小飞守角制作当前第12页\共有52页\编于星期六\9点外胚层中胚层内胚层滋养层内细胞团囊胚(5-6d）移植和培养内细胞团细胞（胚胎干细胞）小飞守角制作当前第13页\共有52页\编于星期六\9点胚胎干细胞培养小飞守角制作当前第14页\共有52页\编于星期六\9点4、胚胎干细胞的应用理论研究（人体发育过程、发育机制和影响因素、体外细胞分化的理想材料）研究新药（细胞药理和毒理实验，药物致病机理）医疗手段（提供无免疫排斥的材料，用于疾病治疗）改良品种（结合基因工程培育生长快、抗病力强、高产的新品种）小飞守角制作当前第15页\共有52页\编于星期六\9点来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病

细胞类型 治疗的疾病神经细胞

中风、帕金森氏病、老年痴呆症、脊髓损伤、多发性硬化病 心肌细胞

心脏病发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞糖尿病软骨细胞 骨性关节炎血细胞 癌症、免疫缺乏症、遗传学血液病、白血病肝细胞 肝炎、肝硬化皮肤细胞 烧伤骨细胞 骨质疏松症视网(眼)细胞 黄斑症骨骼肌细胞 肌肉萎缩症小飞守角制作当前第16页\共有52页\编于星期六\9点三、胚胎干细胞研究面临的挑战1、安全性问题（1）胚胎干细胞的研究给法律、伦理、国家安全等方面带来冲击。①受精卵是生物发育的起点，胚胎是生命开始阶段，以窒息一个生命的代价去挽救另一个生命是否值得。

②可能导致克隆人的出现（2）观点：不应该反对以治疗为目的的胚胎干细胞研究，而反对生殖性克隆。小飞守角制作当前第17页\共有52页\编于星期六\9点胚胎干细胞体外培养条件的优化仍需进一步研究。分化细胞的增殖是一个瓶颈问题，如何得到纯化的分化细胞有很多工作要做。对胚胎干细胞向不同组织细胞的“定向分化”的条件尚不清楚，限制了其临床应用。2、其他技术方面的问题小飞守角制作当前第18页\共有52页\编于星期六\9点建立并完善维持体外增殖与定向分化的体系。研究转基因或核移植胚胎干细胞的增殖与分化及其调控机制。诱导分化细胞的性能分析与鉴定。体外重构重要的组织与器官，探索克服移植排斥反应等的技术和方法。对于胚胎干细胞在组织原位再生修复中的作用机制与原位培养模式的探索。3、未来干细胞研究领域小飞守角制作当前第19页\共有52页\编于星期六\9点胚胎干细胞的培养小飞守角制作当前第20页\共有52页\编于星期六\9点胚胎干细胞研究面临的问题及解决办法

l用于干细胞研究的胚胎来源困难;

l如何保持胚胎干细胞的全能性，并控制向特别类型细胞转化？

l如何分离、纯化干细胞？

l分化后的细胞是否有致瘤性？

l干细胞在体外发育成完整的器官尚难以做到;

l分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥;

l伦理问题

小飞守角制作当前第21页\共有52页\编于星期六\9点应用前景：治疗性克隆面临难题：技术尚需突破社会伦理问题小飞守角制作当前第22页\共有52页\编于星期六\9点观点理由1.不符合伦理道德(1)把试管婴儿当作人体零配件工厂,是对生命的不尊敬;(2)早期的生命也有活下去的权利,抛弃或杀死多余的胚胎,无异于”谋杀”;(3)有人会滥用设计试管婴儿技术,而设计婴儿性别;2.符合伦理道德(1)设计试管婴儿是为了救人,是救治患者的最好,最快捷的办法之一;(2)提供骨髓中造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤;(3)脐带血乃试管婴儿的”身外之物”.3.中国政府的观点中国卫生部在《体外受精----胚胎移植及其衍生技术规范》中规定,”实施体外受精----胚胎移植及其衍生技术必须获得卫生部批准证书”.小飞守角制作当前第23页\共有52页\编于星期六\9点一、掌握核心术语——(记准、写准、理解透，把握内涵和外延)胚胎工程解题策略1.胚胎工程（胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养技术）。2.胚胎发育［受精卵、卵裂、桑椹胚、囊胚（内细胞团、滋养层细胞）、原肠胚］。3.同期发情、超数排卵、冲卵。4.转基因生物、生殖性克隆、治疗性克隆、生物武器。小飞守角制作当前第24页\共有52页\编于星期六\9点二、能概述精子、卵子发生过程和胚胎发育文字流程图，并思考以下问题。小飞守角制作当前第25页\共有52页\编于星期六\9点小飞守角制作当前第26页\共有52页\编于星期六\9点1．要注意区分受精的标志和受精过程结束的标志。受精的标志是卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体，受精过程结束的标志是雌、雄原核融合成合子。二、受精作用相关知识辨析2．要辨别三大反应：顶体反应、透明带反应、卵黄膜封闭作用。（1）发生的时间不同：顶体反应是发生在精子与卵子相遇时；透明带反应是发生在精子触及卵黄膜的瞬间；卵黄膜的封闭作用是发生在精子入卵后。（2）生理作用不同：顶体反应是要形成精子穿越放射冠的通路；透明带反应是防止多精子入卵受精的第一道屏障；卵黄膜封闭作用则是防止多精子入卵受精的第二道屏障。小飞守角制作当前第27页\共有52页\编于星期六\9点3．受精的准备和受精过程要熟悉（1）受精的准备：精子的成熟和获能；卵细胞必须是减数第二次分裂中期。（2）受精过程——四步曲

第一步：精子穿越放射冠和透明带。顶体反应使顶体内的酶释放出来并溶解放射冠内的卵丘细胞之间的物质，透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障。

第二步：精子进入卵黄膜。卵黄膜封闭作用是防止多精入卵受精的第二道屏障。

第三步：原核形成。雄原核形成和雌原核形成。

第四步：合子形成。雌雄原核融合形成合子(受精卵)。小飞守角制作当前第28页\共有52页\编于星期六\9点4．动物排出卵子的成熟程度不同，有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等；有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等，但它们都要在输卵管内进一步成熟，当达到减数第二次分裂的中期时，才具有与精子受精的能力。5．胚胎早期培养过程中有两次用到了显微镜进行检查：①在进行卵母细胞成熟培养前，要抽取卵母细胞在显微镜下检查并挑选；②胚胎培养前要用显微镜检查受精卵。小飞守角制作当前第29页\共有52页\编于星期六\9点（1）受精的标志和受精完成的标志分别是什么？（2）卵裂期、桑椹胚和囊胚中细胞各具有什么特点？①卵裂期的特点：细胞有丝分裂使细胞数目增加，但胚胎总体积并不增加或略缩小，因此每个细胞的体积会随分裂的进行不断缩小，但核内遗传物质并未减少。②桑椹胚以前的细胞均未分化，细胞全能性最高，是胚胎分割的最佳时期。受精的标志是卵黄膜和透明带的间隙出现两个极体；受精完成标志是雌雄原核融合为合子。小飞守角制作当前第30页\共有52页\编于星期六\9点（3）体外受精的操作步骤是什么？答案培养液成分盐类：无机盐和有机盐营养物质：氨基酸、核苷酸调节物质：维生素、激素特有物质：动物血清③桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，是胚胎移植的最佳时期。但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。其中个体较大的细胞叫内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘。①卵母细胞的采集和培养。②精子的采集和获能。③受精。（4）体外胚胎培养液的成分有什么？小飞守角制作当前第31页\共有52页\编于星期六\9点三、胚胎移植1、胚胎移植成功与否的两个重要条件（1）同种动物之间进行胚胎移植易于成功。这里的“同种”是指“同物种”。（2）供、受体生理状态要相同，为此必须做到：①供、受体母畜的发情时间一致。②移入受体子宫胚胎的位置应该与其在供体内的位置相同或相似。2、胚胎移植时间：不同动物其胚胎移植的时间不同。牛、羊要培养到桑椹胚或囊胚阶段；小鼠、家兔在桑椹胚前；人胚胎可在4个细胞阶段移植；几乎所有动物不能到原肠胚阶段移植，因为此时分化程度高，移植成功率很低。小飞守角制作当前第32页\共有52页\编于星期六\9点3．胚胎移植的培育流程以牛胚胎移植为例：(1)选择的对象包括良种公牛、母牛和普通母牛，处理是指对良种母牛和普通母牛做同期发情处理，以使其生殖器官的生理变化相同；同时要对良种母牛做超数排卵处理，以促其多产生卵子。(2)冲卵是指将早期胚胎从良种母牛子宫内冲洗出来，而不是冲洗出卵子。(3)良种牛后代的遗传特性是由供体公牛和母牛决定的，受体母牛只是提供了胚胎发育的场所，不影响后代的遗传特性。(4)胚胎移植培育流程中有两次使用促性腺激素，第一次是对供、受体进行同期发情处理；第二次用于供体的超数排卵。小飞守角制作当前第33页\共有52页\编于星期六\9点3．胚胎移植成功的保障(生理学基础)第一，供、受体生殖器官的生理变化是相同的。第二，哺乳动物的早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能。第三，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。第四，供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎的遗传特性，在孕育过程中不受任何影响。小飞守角制作当前第34页\共有52页\编于星期六\9点

b.原理：细胞核的全能性。c.应用：①快速繁育良种、特异、濒危的动物，改良动物新品种。②利用植物组织培养技术育种。③利用人工种子繁殖物种。④植物体细胞杂交育种。（1）无性繁殖①利用细胞核移植技术育种a.过程育种应用小飞守角制作当前第35页\共有52页\编于星期六\9点⑤核移植和植物体细胞杂交产生的后代中都含有两个亲本的遗传物质；植物组织培养和人工种子产生的后代中都只含有一个亲本的遗传物质。（2）有性繁殖①利用胚胎（分割）移植育种a.过程小飞守角制作当前第36页\共有52页\编于星期六\9点b.原理：细胞（受精卵）的全能性。c.应用：解决动物和人类的不育问题；提高良种家畜的繁殖能力。②单倍体育种技术小飞守角制作当前第37页\共有52页\编于星期六\9点四、试管婴儿与克隆技术

克隆人过程图：会默画出试管婴儿和克隆人的过程图，思考以下问题。试管婴儿过程图：小飞守角制作当前第38页\共有52页\编于星期六\9点试管婴儿克隆人技术基础体外受精、胚胎移植核移植技术、胚胎移植生殖方式有性生殖无性生殖遗传物质遗传物质来自两个个体遗传物质主要来自核供体（1）上述两过程的技术基础、生殖方式、遗传物质方面有什么区别？小飞守角制作当前第39页\共有52页\编于星期六\9点（2）治疗性克隆与生殖性克隆有什么区别与联系？类型项目治疗性克隆生殖性克隆区别目的治疗人类疾病用于生育，产生新个体水平细胞水平个体水平联系

都属无性繁殖；产生新个体、新组织，遗传信息相同

小飞守角制作当前第40页\共有52页\编于星期六\9点巩固提升1.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是（）A.受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态C.超数排卵技术要使用一定的激素D.试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行A2.对于优良种畜的胚胎移植的说法不正确的是()A.供体母牛必须是同一物种的良种B.受体母牛必须是同一物种的良种C.供体公牛必须是同一物种的良种D.受体母牛可以是同一物种的一般健康牛B小飞守角制作当前第41页\共有52页\编于星期六\9点3.供体的胚胎移植到受体后，游离的胚胎在发育过程中形成胎盘与受体相连，并通过胎盘与受体的血液进行物质交换。以下说法正确的是()A.受体是为供体胚胎提供发育的条件B.受体与胚胎血型应相同，否则会发生免疫排斥C.受体与胚胎血液混融在一起D.胚胎心肺功能都能正常运行A4.在胚胎移植中供体的主要职能（）A.提供优良的供体基因B.提供优良遗传特性的胚胎C.提供卵细胞D.提供精子B小飞守角制作当前第42页\共有52页\编于星期六\9点5、下列关于滋养层细胞的叙述，不正确的是（）A.囊胚滋养层细胞将来发育成胎盘和胎膜B.可以用滋养层细胞做DNA分析性别鉴定C.囊胚滋养层细胞就是将来原肠胚的外胚层D.滋养层细胞沿透明带内壁扩展和排列C6、采集的卵母细胞，在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精，以下原因不正确的是（ ）A.卵子从输卵管中冲出也要经历类似精子获能的过程B.动物排出的卵子成熟程度不同C.体外人工培养至减数分裂第二次分裂中期时，才算成熟D.冲出的卵子还需要培养一段时间由小变大D小飞守角制作当前第43页\共有52页\编于星期六\9点9、利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的最重要原因是（）

A.细胞分裂B.细胞特化C.细胞分化D.细胞增殖10、“试管婴儿”技术属于()A.胚胎移植B.组织培养C.克隆技术D.基因工程A11.下列各项中与“试管婴儿”的培育有关的是 （ ）①体外受精②体内受精③主要在体外发育④主要在体内发育⑤运用基因工程技术⑥运用胚胎工程技术A.①③⑥ B.②③⑥ C.①④⑥ D.①④⑤CC小飞守角制作当前第44页\共有52页\编于星期六\9点

（1）图中a、b、c过程分别是指

、

、

。（2）供体母牛的主要职能是

；受体母牛必须具备

。超数排卵冲卵胚胎移植只产生具有优良遗传特性的胚胎健康的体质和健康的繁殖能力12、（09·深圳3月）牛胚胎移植的基本程序如图所示，请据图回答：小飞守角制作当前第45页\共有52页\编于星期六\9点（3）为了提高牛胚胎的利用率，常采取的方法是

；处理的时期是

；理由是

。（4）从哺乳动物早期胚胎或原始性腺中分离出来的细胞，称为ES或EK细胞。这类细胞的形态特征有

。（5）你认为胚胎移植技术在生产实践中的主要意义有哪些？

。胚胎分割移植桑椹胚或囊胚期此时还未出现细胞分化或分化程度低体积小、细胞核大、核仁明显胚胎移植技术可以加快优良种畜的繁殖速度，迅速推广新品种关键信息“供体母牛”、“受体”、“提高牛胚胎利用率”小飞守角制作当前第46页\共有52页\编于星期六\9点13.（09·南通期末调研）下图是培育能产生凝血因子牛的过程示意图，试回答相关问题：（1）为能从良种母牛体内一次取得多枚卵子，可以采用

的方法。据报道，这种技术已经被滥用于人类生育中，从而出现许多人工“多胞胎”，这种技术带来的危害之一是

。注射促性腺激素影响胎儿的健康发育、对孕妇的身体不利等小飞守角制作当前第47页\共有52页\编于星期六\9点（2）在过程③中，当一个精子进入卵细胞后会激发卵子发生反应，如透明带反应等，其意义是

。（3）过程④中为保证人凝血因子基因能够在受精卵中稳定存在并表达，需要先将该基因与

结合，检验人凝血因子基因是否导入受精卵的方法是

。（4）过程⑥涉及的技术是

，为保证该过程的成功，一般应选择

相同的同种母畜。防止多精入卵载体运用目的基因探针进行检验（DNA分子杂交技术）`胚胎移植生理状态小飞守角制作当前第48页\共有52页\编于星期六\9点14.（09·海南4月模拟）克隆羊“多利”