第五章分子生物学研究法()核酸技术

第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

核酸的凝胶电泳p.173

1)基本原理:

在生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态,所以DNA和RNA多核苷酸链是带负电的,把这些核酸分子放置在电场中,它们就会向正电极的方向移动。

迁移:核酸分子在电场中的移动。

电泳的迁移率:核酸分子在电场中的迁移速度。在一定的电场强度下,迁移率取决于核酸分子本身的大小和形状(超螺旋结构、开环、线性的DNA）。

这就是应用凝胶技术分离DNA片段的基本原理。

当前第1页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

2)琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶介质-琼脂糖是一种线性多糖聚合物,将琼脂糖加热到熔点后冷却凝固便会形成带有孔隙的电泳介质,其孔隙的大小和胶的浓度有关,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力越强,反之则越弱。

-聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵)作用下形成的凝胶。-琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围是:0.2–50kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段范围是:1-1000bp之间。

当前第2页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

表:琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力___________________________________________________凝胶类型及浓度分离DNA片段的范围(bp)___________________________________________________0.3%琼脂糖50000-10000.7%琼脂糖20000-10001.4%琼脂糖6000-3002%琼脂糖3004%聚丙烯酰胺1000-10010%聚丙烯酰胺500-2520%聚丙烯酰胺50-1___________________________________________________当前第3页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

3）核酸染色与检测染色剂：溴化乙锭(

ethidiumbromide,简称EtBr)

它的分子呈扁平状，可以插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间；在紫外光照射下,它呈现出桔黄色荧光,荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。

嵌入的EtBr分子EtBr正常DNA双链嵌入了EtBr的DNA双链图:溴化乙锭对DNA分子的插入作用当前第4页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（1）染色方法

在熔胶冷却到~50℃时,将EtBr加入胶中,当DNA分子在凝胶介质中移动时能够吸收EtBr,但EtBr不能与凝胶介质相结合,多余的EtBr则进入到电泳缓冲液中。

把含有DNA分子的凝胶胶板浸泡在EtBr溶液中片刻,然后将胶取出,并放置在紫外光下进行观察。（2）检测将染色凝胶放置在紫外光下观察,即可检测出凝胶介质中DNA带位置。如果在加样时,其中一个样品槽中加入DNA标记物，通过与标准DNA的谱带位置相比较,便可推测出目的DNA片段的大小,同时还可以估计出DNA的浓度。当前第5页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

质粒DNA酶切验证图谱当前第6页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

-GoldViewI型核酸染色剂是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。

SuperGreenI型核酸染色剂

GeneFinder核酸染色剂

溴化乙锭的无毒代替物：当前第7页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

4）脉冲电场凝胶电泳(PFGE)p.174图5-6

适用于分离50kb以上的DNA超大片段。

原理:在脉冲式交变电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期变化而不断改变。在标准的PFGE中,第一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45°夹角,而第二个脉冲的场方向与核酸移动方向在另一侧成45°夹角,由于凝胶质的电场方向的变化,使得DNA分子能够随时调整其移动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。当前第8页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

图:在脉冲凝胶电泳中的等高压均匀电场获得的染色体DNA电泳图谱

家蚕病原白僵菌至少有6条染色体,估算其大小在2.5～7.2Mbp之间,3种分离菌株间存在多型性。当前第9页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

2.核酸的分子杂交

就是将待测定核苷酸序列的单链DNA或RNA与探针混合，如果DNA或RNA片段中含有与探针互补的序列,那么其相应的同源区段就会形成双链结构,反之。

探针:

是指经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。

-DNA分子杂交（DNA印迹杂交,Southernblotting)

-RNA分子杂交(RNA印迹杂交

,Northernblotting)

当前第10页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

1）DNA分子杂交技术-Southernblotting

用于检测DNA片段中是否存在与探针同源的序列

因此，可以用于分析外源基因在宿主染色体DNA中的整合等情况。当前第11页\共有100页\编于星期五\22点12345CKSouthernbloting当前第12页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（1）DNA印迹杂交原理-基因组DNA的限制性酶切及片段的琼脂糖凝胶电泳分离-碱处理使待测定的DNA片段变性-固定在滤膜表面（转膜）-加入经标记的单链探针进行杂交-如果待测定的DNA片段存在与探针同源的序列,他们可通过碱基互补作用形成双链,根据探针标记物的特性对杂交结果进行检测。当前第13页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（2）滤膜的种类及选择滤膜必须具备如下特点:能很好地与DNA(RNA)分子结合不影响DNA片段与探针杂交对探针及其他物质的非特异性吸附力小具有良好的机械性常用滤膜有:硝酸纤维素膜只能与单链DNA/RNA在高盐条件下结合,膜与DNA片段以疏水性结合,烘干后结合能力强。但不适于电转移法；对小于200bp的片段结合力差；膜不可重复使用。尼龙膜*二乙氨基乙基纤维素滤膜当前第14页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（3）DNA探针的种类放射性(32P)和非放射性探针均匀标记和末端标记探针

当前第15页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

-非放射性标记物生物素(biotin):是一种水溶性B族维生素,又称维生素H。

特点：既能与核苷酸、核酸发生偶联反应又可与抗生物素蛋白/抗体等结合偶联反应：是通过生物素与dUTP分子中嘧啶碱基的第5位的碳原子之间的碳链共价结合,形成

biotin-11-dUTP和biotin-16-dUTP复合物。

当前第16页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

制备生物素标记探针：生物素-dUTP可取代dTTP而被整合进DNA探针

生物素标记的探针杂交结果可通过下列两种途径检出：

生物素-抗生物素蛋白的亲和系统

生物素-抗生物素抗体的免疫系统当前第17页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

用生物素标记DNA探针-呈色/荧光法检测杂交信号技术硝酸纤维滤膜靶标DNAPPPPPP生色或荧光诱发物质P呈色或发出荧光碱性磷酸酯酶链球菌抗生物素蛋白生物素(biotin)生物素标记的探针图:用呈色法或荧光法检测核酸杂交信号当前第18页\共有100页\编于星期五\22点图13-9生物素标记探针检测核酸过程示意图

当前第19页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

（4）DNA分子杂交方法

-Southern斑点杂交将经变性处理的DNA样品直接点在滤膜上,固定后与探针杂交缺点：假阳性出现频率高用于快速检测基因的整合情况-Southern印迹杂交基因组DNA经酶切、电泳分离、变性、印迹转移、固定后与探针杂交和检测用检测基因的整合和拷贝数等情况

-Southern原位杂交是将变性染色体固定在玻片上与探针进行杂交。用于检测基因在染色体上整合的位置当前第20页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

基因组DNADNA限制片段凝胶电泳分离DNA变性DNA印迹转移固定、杂交检测酶切Southern印迹杂交过程当前第21页\共有100页\编于星期五\22点图13-10Southern印迹杂交过程

当前第22页\共有100页\编于星期五\22点Southern原位杂交当前第23页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

2)RNA分子杂交技术-Northernblotting

Northern杂交是指用从生物细胞中提取的总RNA或mRNA与探针分子杂交

因此，可用于分析外源基因在受体生物中的转录情况当前第24页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

(1)RNA印迹杂交原理

检测原理和步骤与Southern印迹杂交大致相同

不同之处：

应用变性琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的RNA分子变性琼脂糖凝胶：在胶液中加入变性剂

甲醛常用变性剂乙二醛*等*乙二醛的两个乙醛基团可与鸟嘌呤的亚氨基团反应，形成环状衍生物以维持RNA的变性状态。

当前第25页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

为什么要使用变性琼脂糖凝胶介质？？因为只有在变性条件下电泳，破坏RNA的空间结构,才能使RNA在凝胶介质中的迁移距离与其分子质量对数值成正比。

当前第26页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

RNASecondaryStructure当前第27页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

(2)

RNA印迹杂交方法

-Northern斑点杂交用于快速检测目的基因转录情况,但不能检测出转录的mRNA片段大小。

-Northern印迹杂交用于检测目的基因转录情况,同时可以检测出mRNA转录本的大小及其转录水平等。

当前第28页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

例:Northern印迹杂交结果

图:DcLEA1基因在胡萝卜体细胞胚发育的不同阶段的表达

上图为Northern杂交结果,下图为总RNA电泳图(10ug/泳道)泳道1.调控状态下的体细胞胚泳道2-5.分别为解调控12、24、36、48h的体细胞胚

28s18s当前第29页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

注意：细胞中的总RNA包括：mRNA占1-5%rRNA80-85%tRNA和sRNA14-19%rRNA电泳后可以观察到3条特征条带：28S18S5S*因此，rRNA的特征条带是用来鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数当前第30页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

RNA印迹杂交中注意的两点:电泳凝胶中不加EtBr,因EtBr与RNA结合后迁移速率下降。

所有的器皿、水和试剂必须经RNase灭活处理，防止RNA的降解。

当前第31页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法三.核酸操作技术

内容回顾：凝胶电泳技术难点：大于50kb片段的电泳分离。Sourthern杂交技术难点：酶切和变性。Northern杂交技术

难点：去除RNase；跑变性胶。

当前第32页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术是模拟体内DNA复制过程,在体外快速扩增特定DNA序列的方法。

当前第33页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

1)发展历史1985年，美国科学家KaryMullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术。1988年初，Keohanog通过对酶的改进，提高了扩增的真实性。1988年，Saiki等人水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。1993年，KaryMullis因此而获得诺贝尔化学奖。

当前第34页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

2)PCR反应原理

DNA聚合酶能够以引物3’-OH为起点，催化dNTP按模板顺序，合成与模板互补的新链。PCR反应的过程，即DNA解链、引物与模板DNA结合、链的延伸可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数达到2n，能满足进一步遗传分析的需要。

扩增体系包括：模板DNA（单、双链DNA）

引物4种等量混合的dNTPDNA聚合酶

DNA聚合酶的缓冲液

P.177图5-9当前第35页\共有100页\编于星期五\22点当前第36页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

3)模板DNA的制备PCR对模板DNA的质量要求不高,可用：细胞裂解液提取的染色体DNA质粒DNA当前第37页\共有100页\编于星期五\22点4)DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（来自Thermusaquatics）

特点：5’—3’的聚合酶活性5’—3’的核酸外切酶活性无3’—5’的核酸外切酶活性

扩增的DNA片段在3’有一个突出的A碱基。可以选用“T”载体进行扩增片段的克隆，常用的载体有pGEM-T，质粒两末端突出的T与片段两端突出的A互补。

第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

当前第38页\共有100页\编于星期五\22点pfuDNA聚合酶（来自激烈热球菌Pyrococcusfariosus）

特点：

5’—3’的聚合酶活性5’—3’的核酸外切酶活性3’—5’的核酸外切酶活性扩增的DNA片段为平末端。可用开环(EcoRV单酶切)的pBluescript质粒克隆。第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

当前第39页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

5)PCR循环参数

_____________________________________________________

温度反应时间循环数______________________________________________________

预变性94-95C45s-5min，取决于模板的复杂性1(a)变性94-95C取决于聚合酶的种类(b)退火(anneal)取决于引物的

长度、GC含量

取决于聚合酶种类

及引物与模板的

25-30

配对程度(c)延伸72C取决于被扩增片段大小完成72C5-10min,取决于聚合酶种类1________________________________________________________________当前第40页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

例:

PCR参数

反应体系

阶段温度时间循环数DNA模板1l预变性94℃

45’’1引物11l(50ng/l)引物21l(50ng/l)变性94℃

45’’dNTPs1l(10mM/每种)退火

45’’25Pfu缓冲液5l延伸72℃Pfu聚合酶0.5lH2O40.5l完成72℃

10min1Tm=55℃;PCR扩增产物长度是3044bp。PfuDNA聚合酶，每扩增1000bp需要1-2min。50℃6min当前第41页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

6)扩增产物检测用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳（片段小于100bp）。检测是否有特异性扩增产物,与标准DNA分子片段（DNAMarker）相比较，判断扩增片段的大小是否正确。

当前第42页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

例:PCR扩增产物的电泳检测

图:DcLEA1基因PCR鉴定泳道1-9：不同样本PCR扩增产物泳道M：分子量标记泳道10：阴性对照856bp1234567M8910Kb215.04.22.01.51.30.90.5当前第43页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

7)引物设计及合成

用于PCR扩增的引物，一般为15-30个核苷酸，主要通过人工合成获得。

引物设计的基本原则:

引物中的(G+C)含量应在45-65%;4种碱基应随机分布,避免单一碱基的连续排列；防止引物内部形成二级结构(loop);两引物之间不应发生互补,尤其在引物的3’端要避免“二聚物”的形成；如需引入酶切位点，酶切位点通常放在引物的近5’端。一般情况下,引物的设计应利用计算机软件进行。

当前第44页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

2.

反转录-PCR(reversetranscribed-PCR，RT-PCR)技术

用于cDNA（complementaryDNA，互补DNA）的合成。1）原理是以提取的总RNA或mRNA为模板进行反转录合成第一链cDNA,并以此为模板，进行PCR扩增。

当前第45页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

RT-PCR反应包括：cDNA的合成

两个部分cDNA的扩增

当前第46页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

2）第一链cDNA的合成p.187-以mRNA为模板-DNA引物-由反转录酶催化-四种等量混合的dNTP

使用什么引物????当前第47页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

以olig(dT)为引物合成mRNA的第一条cDNA链。P.187

5′

AAAAAA3′mRNA

3′TTTTTTT5′cDNA反转录酶

olig(dT)引物

mRNA3’端的互补序列为引物5′AAAAAA3′mRNA3′5′cDNA反转录酶

特异引物随机引物当前第48页\共有100页\编于星期五\22点RT-PCR过程示意图当前第49页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

3）第二链cDNA合成

-以第一链cDNA为模板-引物-由DNA聚合酶催化-dNTP引物从何而来??当前第50页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

cDNA第二链的合成方法有两种:自身引导法-第一条cDNA链合成后，cDNA:RNA杂交链变性；-

利用单链cDNA3’端能够形成一短的发夹结构，为第二条cDNA链的合成提供引物；-由大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段催化合成第二条cDNA链；-用对单链特异性的S1核酸酶切除末端的发夹结构，得到cDNA双链。缺点：合成反应较难控制，而且用S1核酸酶切割发夹结构时会导致末端序列的缺失，因而该方法目前很少使用。当前第51页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

置换合成法第一条cDNA链合成后，产生的cDNA:mRNA杂交链无需变性。-用RNaseH酶切割杂交链中的mRNA链，在mRNA链上造成切口和缺口，利用一系列小的RNA片段为引物。-由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ催化合成第二条cDNA链。-最后由DNA连接酶将小的cDNA片段连接成完整的cDNA链。

当前第52页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

RNaseH：-是一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链中RNA链。-该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA没有作用。

当前第53页\共有100页\编于星期五\22点当前第54页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

置换合成法的优点:

-非常高效。-直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化。-不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环，能保持cDNA序列的完整性。是目前合成cDNA常采用的方法。当前第55页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

cDNA的扩增以cDNA单链或双链为模板，在特异性引物的引导下，进行PCR扩增。当前第56页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

4）cDNA文库的构建p.188

cDNA文库：

从真核生物的组织或细胞中提取各种RNA，通过RT-PCR合成cDNA，将双链cDNA分别和适当载体连接后，转化宿主细胞，所获得菌落或噬菌体的集合即为该生物的cDNA文库。

克隆载体：cDNA的长度一般在0.5-8kb。常用载体有：质粒载体和噬菌体载体。

当前第57页\共有100页\编于星期五\22点cDNA文库的构建过程当前第58页\共有100页\编于星期五\22点cDNA文库的用途：-可用于真核生物基因的克隆、表达和调控的分析;-比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。当前第59页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

3.反向PCR(reversePCR)

用于扩增已知DNA区段之外的末知序列。

原理:先用一种已知

DNA区段上没有切割位点的限制性内切酶,从已知

DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子,然后将这些片段作分子内连接成环形。根据己知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对引物,保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的末知DNA序列。

当前第60页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法四.

基因扩增

引物1引物2引物1引物2图:反向PCR的基本操作程序引物2当前第61页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

Sanger双脱氧链终止法(Sanger和Coulson，1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam和Gilbert，1977)DNA自动测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法大规模平行测序法、DNA芯片法

经典方法新方法当前第62页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

1.Sanger双脱氧链终止法（引物合成法）1）

原理:利用DNA聚合酶在体外合成DNA时，能够将2’,3’-ddNTP（双脱氧核糖核苷三磷酸）掺入到寡核苷酸链的3’-末端这一特点设计。

当前第63页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

当前第64页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析5´3´5´5´3´3´ddNTP掺入到DNA合成反应后导致反应终止正常的DNA合成反应当前第65页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

在测序反应体系中加入：-模板DNA(3’5’的单链)-特异性引物（带标记的）-DNA聚合酶（测序酶）-dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一种ddNTP在合成反应中，当这种2’,3’-双脱氧ddNTP加到寡核苷酸链生长末端,由于ddNTP没有3’-OH基团,寡核苷酸链不能继续延长。在同一反应中,将会合成出不同长度的DNA片段混合物，这些片段具有相同的5’-末端和以ddNTP结束的3’-末端。当前第66页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

将这种混合物加到可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA片段的变性凝胶中进行电泳分离,就可以获得一系列全部以3’-末端ddNTP为终止残基的DNA片段的电泳图谱。通过放射自显影的方法检测单链DNA片段的放射性条带,就可以直接读出DNA的核苷酸顺序。

当前第67页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

双脱氧链终止法测序的基本原理和过程

凝胶电泳方向3’AGTTGCTA5’测序胶的判读*放射性标记(测序酶)当前第68页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

2.Maxam-GilbertDNA化学降解法

1）原理:

用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此在同一反应中产生具有共同起点(放射性标记末端)到发生化学切割位点的一组长度不同的DNA片段。反应混合物经凝胶电泳分离和放射自显影之后,便可根据X光片底板上所显现的相应谱带,读出DNA片段的核苷酸顺序。当前第69页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

2）方法（1）DNA样品制备

首先要对待测定的单链DNA片段的5’端作末端标记。

（2）碱基切割常用的化学试剂:

硫酸二甲酯

-在酸性条件下,对G特异性切割-在中性条件下,它作用于G+A。

肼又称联氨(NH2•NH2)-在碱性条件下,它能够作用于T+C.-在NH2•NH2+盐的条件下,对C特异性切割。

当前第70页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

硫酸二甲酯酸性中性肼碱性+盐

32P图:Maxam-GilbertDNA化学降解法原理当前第71页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法这两种序列测定技术原理大同小异。它们都是生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种核苷酸残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因此上述每一组产物都是一些长短不同的寡核苷酸混合物。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，即可以从凝胶的放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸序列。当前第72页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

3.DNA序列自动分析法

原理:

-基于Sanger双脱氧链终止法的原理，使用四种不同的

荧光染料分别标记ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。-这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。-延伸中的DNA互补链分别终止于不同荧光标记的ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。

-荧光检测系统将荧光信号转换为电信号,经过数据处理系统处理,最后把所测得的序列直接打印出来。

当前第73页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

当前第74页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

ddAddGddTddGddCddCddAddCddGddT激光激发荧光信号AGTGCCACGT电泳链终止反应当前第75页\共有100页\编于星期五\22点当前第76页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法五.

核苷酸序列分析

4.DNA杂交测序法（芯片测序）

原理:利用一组己知序列的寡核苷酸短序列作为探针,同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交,从而测定其核苷酸的序列。当前第77页\共有100页\编于星期五\22点杂交测序法(SBH)：

应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。当前第78页\共有100页\编于星期五\22点12-mer的靶DNA序列：AGCCTAGCTGAA靶DNA的互补序列运用八聚体探针微型高密度寡核苷酸点阵的制备当前第79页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法六.

DNA与蛋白质相互作用研究

凝胶阻滞试验(DNA迁移率变动试验)

用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。原理:在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA向正极方向移动的距离与其相对分子质量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合,那么它的相对分子质量增大,它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,在同样的电泳电压和时间内向正极移动的距离也就相应缩短。

当前第80页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法六.

DNA与蛋白质相互作用研究

(a)(b)(c)图:在凝胶阻滞实验中竞争DNA与标记DNA之间的竞争作用

凝胶电泳放射自显影特异性蛋白质标记DNA竞争DNA蛋白质与竞争DNA结合蛋白质与标记DNA结合阻滞条带阻滞条带当前第81页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法六.

DNA与蛋白质相互作用研究

2.DNaseI足迹试验(DNAfoot-printingassay)

原理:先将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记,并用限制性内切酶去掉其中的一个末端,得到只有一个末端标记的双链DNA分子,然后与蛋白质混合。

在标记的DNA样品(对照）和蛋白质、标记DNA混合物中分别加入少量的DNaseI对DNA分子进行切割。

当前第82页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法六.

DNA与蛋白质相互作用研究

如果某种特异蛋白能够与DNA分子的某一特定区段结合,那么,它将保护DNA这一区段上的酶切位点免受DNaseI的切割,因而也就不能产生出相应长度的切割条带(与对照相比)，在电泳凝胶的放射自显影图片上,与对照相比将出现一个空白区域，这一区域被称之为“足迹”。

当前第83页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法六.DNA与蛋白质相互作用研究

加入DNaseI凝胶电泳放射自显影足迹图:DNaseI足迹试验标记的靶DNA片段,箭头为DNaseI酶切位点；标记的DNA与特异蛋白结合后,切割位点6,7,8被蛋白质保护而免受DNaseI的切割；DNaseI切割、凝胶电泳后的放射自显影。A为对照;B为样品(标记DNA+蛋白质)。

678当前第84页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法七.

Western印迹杂交

Western印迹杂交(Westernblotting)技术

用于检测目的基因在蛋白质水平的表达情况。如果目的基因的表达产物是一种酶,则可以通过测定转基因生物体中该酶的活性,来达到了解该基因表达情况的目的。如表达产物不是酶,那么就要采用免疫学方法(Westernblotting)检测。

当前第85页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法七.

Western印迹杂交

Western印迹杂交原理

当目的基因在生物体内正常表达时,组织细胞中含有一定量的目的蛋白。

-用目的蛋白的抗体(称为一抗)与目的蛋白反应；-再用能与一抗特异结合的标记抗体(称为二抗)反应；-最后通过二抗上标记化合物的性质对杂交结果进行分析。

当前第86页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法七.

Western印迹杂交

2.Western杂交方法有印迹杂交和斑点杂交之分。1)Western印迹杂交分析（1）蛋白质的提取（2）蛋白质样品的处理

采用含有SDS(十二烷基硫酸钠)和-巯基乙醇的样品缓冲液处理蛋白质样品。当前第87页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法七.

Western印迹杂交

SDS的作用：

-使蛋白质的亚基解聚,SDS阴离子与松散多肽链结合。-使样品中的蛋白质与SDS结合后,都带上大量的负电荷（由于SDS带有大量负电荷）,这样各蛋白质分子间原有的电荷差异就被掩盖,剩下的只是分子质量的差异,此时,蛋白质分子的电泳迁移率取决于它们的分子质量。

-硫基乙醇：

-

使二硫键还原,多肽链由特定的三维结构变为松散的伸展状。当前第88页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法七.

Western印迹杂交

（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳分离

用SDS(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis

)凝胶电泳分离。在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。

(4)

蛋白质印迹转移

硝酸纤维素滤膜,疏水作用与蛋白质结合。当前第89页\共有100页\编于星期五\22点第五章分子生物学研究法七.

Western印迹杂交

（5）膜的封闭

将滤膜浸泡在一种非特异性的蛋白溶液中为什么要进行封闭处理？？-由于第一抗体是蛋白质