第六讲基因治疗

第六讲基因治疗1第一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一基因治疗分类体细胞(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代2第二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一一、基因治疗的策略

内容提要二、基因转移技术

四、治疗基因的受控表达三、基因干预五、基因治疗的应用研究3第三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

一、基因治疗的策略TheStrategyofGeneTherapy4第四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

（一）基因置换（genereplacement）

定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。

目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。5第五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一又称为基因打靶(genetargeting）定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术6第六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞的基因缺陷部位。定向导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。7第七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（二）基因添加

基因添加或称基因增补（geneaugmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。8第八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（三）基因干预基因干预（geneinterference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。9第九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（四）自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。10第十页，共四十一页，编辑于2023年，星期一自杀基因的作用机制

11第十一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一☻TK/GCV

单纯疱疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。☻CD/5-FC

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自杀基因系统12第十二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

2.旁观者效应13第十三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（五）基因免疫治疗通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。14第十四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一二、基因转移技术

TheTechniqueofGeneTransfer15第十五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一基因治疗的两种途径载体目的基因invivoexvivo靶细胞16第十六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

基因转移(genetransfer)技术：

1.病毒介导的基因转移系统。

2.非病毒介导的基因转移系统。17第十七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

1.病毒介导的基因转移系统

病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。18第十八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一Retrovirus

（1）逆转录病毒

19第十九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一20第二十页，共四十一页，编辑于2023年，星期一（1）两端各有一长末端重复序列LTR。

逆转录病毒前病毒的结构特点

（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。（3）病毒有三个结构基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。

（5）含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点(PPT)。

(1)在U3内有增强子和启动子；

(2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS)

；(3)在R内还有poly(A)加尾信号。

(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；(2)pol基因，编码逆转录酶；(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

21第二十一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一22第二十二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一逆转录病毒介导的基因转移系统

——由两部分组成：

(1)逆转录病毒载体

(2)辅助细胞株(如PA317)23第二十三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一Retroviralpackagingsystem24第二十四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

逆转录病毒载体的特点

①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。

②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。

③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。

④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。

25第二十五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

逆转录病毒载体的主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因。26第二十六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体

腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。27第二十七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一28第二十八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一腺病毒的优点1.基因导入效率高，对人类安全；2.宿主范围广；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因；29第二十九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

腺病毒载体缺点2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组；(2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。30第三十页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

（3）腺病毒相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAVVirusParticles31第三十一页，共四十一页，编辑于2023年，星期一StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒复制基因,CAP:编码衣壳蛋白的基因32第三十二页，共四十一页，编辑于2023年，星期一AAV的特点●以潜伏感染为主；●病毒基因组与细胞共存；●只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；●若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制；●产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。33第三十三页，共四十一页，编辑于2023年，星期一AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。

34第三十四页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

AAV载体的缺陷：

AAV载体容量小，目前最多只能容纳5kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。35第三十五页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

2.非病毒载体介导的基因转移系统

（1）脂质体介导的基因转移技术脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。

基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。

36第三十六页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

脂质体介导的基因转移示意图37第三十七页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

（2）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。38第三十八页，共四十一页，编辑于2023年，星期一受体介导转移技术示意图39第三十九页，共四十一页，编辑于2023年，星期一

（3）基因直接注射技术不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%；2.将胰岛素基因直接