酵母RNA的提取及含量测定

RNA的提取及含量测定一、 实验目的与要求1、 了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法；2、 了解测量核酸浓度不同方法的原理；3、 熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法；4、 熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、 实验原理1、 RNA提取原理：由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90°C提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。2、 测定RNA含量的方法：紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260纳米处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比(0—50微克/毫升)，符合朗伯-比尔定律。优点样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。地衣酚显色法：核酸与浓盐酸共热，放生降解，生成糠醛，后者与地衣酚反应，在三价铁离子或二价铜离子作用下，生成鲜绿色的复合物，670纳米处有最大吸收，且光吸收值与浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。缺点反应特异性差，易受干扰。定磷法：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中无机磷酸生成磷钼酸，当有还原剂存在时，磷钼酸立即被还原生成蓝色的还原产物一钼蓝，其最大吸收在660纳米处，当无机磷含量在每毫升1-25微克范围内，光吸收与含磷量成正比。测量样品核酸的总磷量，需先将它用硫酸或高氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可计算出核酸3、紫外吸收法测定RNA含量：核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌吟、嘧啶碱基具有共轭双健系统(-c=c一C=C-)，能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌吟、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以£（P）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。RNA溶液（pH=7.0）的£（p）=7700-7800，RNA的含磷量为9.5%，含川g/mLRNA溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3pg/mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。三、 主要仪器和试剂干酵母粉、pH试纸、电子天平、分析天平、100ml烧杯、量筒、吸管、离心机（4000r/min）、95%乙醇、无水乙醇、酸性乙醇、0.2%NaOH溶液、紫外分光光度计、200ug/ml的标准核酸四、 实验步骤1、 称4g干酵母粉放入200ml三角瓶中加入40ml0.2%NaOH溶液混匀；2、 三角瓶沸水浴30min后流水冷却，转入离心管，4000r/min离心15min，结束后保留上清液，加入40ml酸性乙醇，边加边搅拌；3、 加毕，静置5min，待RNA沉淀完全后，4000r/min离心5min。弃去上清液，保留沉淀，用20ml95%乙醇洗涤分两次沉淀，每次洗完后3000r/min离心5min。4、 再用20ml无水乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗完后3000r/min离心5min，收集沉淀到滤纸上备用。5、 准确称取0.2—0.25克样品核酸，加2毫升0.2%氢氧化钠溶液和1毫升水溶解，调成糊状，再加入50毫升左右水溶解，边溶解边转移到100毫升烧杯中，用0.2%氢氧化钠调至中性，定容至100毫升，再取3毫升定容至100毫升备用含量。优点测量准确，缺点操作繁琐。（由于要做平行实验，因此是从最先定容的100ml中分别取3次3ml，再分别定容至100ml）。（开始溶液呈乳白色，完全溶解后变为澄清透明溶液）注：本次实验一共称取了0.1765g样品。6、 制作标准曲线（标准核酸稀释至100ug/ml），测定样品。五、 实验结果1、实验数据：

管号标准曲线样品012345678标准核酸/ml00.81.62.43.24.0不加水/ml109.28.47.66.86.0000样品/ml不加101010浓度ug/ml0816243240\\X吸光度00.2140.3380.4580.6170.7650.6200.6180.628六、实验结果分析本次实验测得样品中RNA的含量为61.5%，总体来说还算可以，但仍有些许误差，造成误差的原因可能有以下几种：1、 因为是做了三次平行试验，所以在样品三次定容时可能有些许误差。2、 在配置标准RNA浓度时可能量取时有误差而导致RNA浓度有些许的误差。3、 样品中可能含有少量蛋白质，DNA，对紫外光也有强吸收作用会产生误差。4、 酵母RNA被溶解后调PH时由于用的是PH试纸而不是PH计这种较为准确精密的仪器