细胞免疫学技术课件

细胞免疫学技术

6/6/20231细胞免疫学技术种类

细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行分离、鉴定、计数，并测定其功能。

细胞分离技术免疫细胞表面标志和功能的检测

T细胞表面标志和功能的检测

B细胞表面标志和功能的检测

NK细胞活性的检测吞噬细胞检测技术6/6/20232第一节免疫细胞的分离技术一、标本的采取与保存二、细胞分离技术三、分离标本的保存技术6/6/20233第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（一）血液标本的采取无菌采血，抗凝1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。2、肝素抗凝法

肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法EDTA为螯合剂，可与血液中钙离子结合而抗凝。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。6/6/20234第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（二）胸腺细胞悬液的制备【方法】4周龄健康小鼠，体重14~16g。（1）小鼠颈椎脱臼处死。（2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无菌，洗干净胸腺上的血管。（3）轻轻研磨，制成细胞悬液。（4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数＞90%。看视频6/6/20235第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（三）巨噬细胞的采取1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法）2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备【方法】20-25g小白鼠（1）小鼠颈椎脱臼处死（2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液（3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度6/6/20236第一节细胞的分离技术二、细胞分离技术（一）外周血白细胞的分离

根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降速度随之而异。1、自然沉降法利用RBC自然沉降率较快的分离法。抗凝血于室温或37℃静置30~60分钟，血液即分成明显的3层：上层为淡黄色血浆，紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞底层为红细胞本法所得的白细胞损伤极轻微。6/6/20237第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（一）外周血白细胞的分离2、加速红细胞沉降法

利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞分离。上层富含白细胞红细胞凝聚成串钱状沉积在底层，本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白细胞粘性，对实验有所影响。6/6/20238第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（二）外周血单个核细胞的分离（PBMC）[基本原理]根据人类各种血细胞的比重有所不同，利用一种比重介于1.075~1.092之间而接近等渗的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而得以分离各种血细胞群。

表7人外周血细胞密度一览表—————————————————细胞密度（kg/m3）—————————————————红细胞＞1.092粒细胞1.070~1.090淋巴细胞和单核细胞1.060~1.075血小板1.030~1.035—————————————————6/6/20239第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（三）淋巴细胞及其亚群的分离1、淋巴细胞的分离①玻器吸附法将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置37℃30min～40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。

②L-亮氨酸甲基酯法

单核-巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的L-亮氨酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有毒性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响T、B、NK等细胞。用本法获得的淋巴细胞纯度大于99％，活力＞95％。6/6/202310第一节细胞的分离技术一、标本的采取与保存（三）淋巴细胞及其亚群的分离

2、淋巴细胞亚群的分离根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞的技术。①E花环试验分离T细胞群②尼龙毛分离方法分离T、B细胞③亲和层析原理分离淋巴细胞亚群去除某一细胞群④荧光激活细胞分离仪（FACS）最佳分离方法磁性微球用于细胞的分离和纯化（MACS技术）6/6/202311免疫磁性微球的分离原理

直接法对细胞进行分类抗CD3磁球磁球结合T细胞加入B和T细胞中负向选择正向选择磁架进行分离间接法对T细胞进行分离单克隆抗体CD3羊抗鼠修饰磁球BiomagT细胞T细胞6/6/202312第一节细胞的分离技术三、分离标本的保存技术液氮深低温（－196℃）保存技术

但降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变，可导致细胞的损伤和部分死亡。因此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常用二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。1、冷冻保存

将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装小管。采用两步降温法，即及时迅速地将其降温至一选择好的临界低温作为过渡站，如一80℃低温冰箱过夜，或放在液氮罐液面以上一层空间15~20h，然后再移放或沉入液氮中。2、复苏

复苏解冻必须迅速，力争在20s内使细胞完全融化。从液氮中取出后迅速移至40℃温水中，融化后要充分洗涤重悬于新鲜培养液中，使细胞恢复活力。6/6/202313第二节免疫细胞表面标志和功能的检测

一、T细胞标志及功能的检测

（一）T淋巴细胞受体的检测1、E受体的检测

（现多用于分离T细胞）2、白细胞介素-2受体的检测

T细胞激活的特征

（多采用免疫组化学法）

6/6/202314第二节免疫细胞表面标志和功能的检测一、T细胞标志及功能的检测（二）表面抗原的检测

用单抗检测T细胞表面抗原方法：标记抗体着染法抗体致敏花环法

1、间接免疫荧光法

淋巴细胞+抗相应CD的单抗→洗涤→再加荧光二抗→洗涤→取样制片→荧光显微镜观察计数l00~200个淋巴细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性的T细胞百分率。6/6/202315第二节免疫细胞表面标志和功能的检测一、T细胞标志及功能的检测（二）表面抗原的检测

2、抗体致敏细胞花环法

淋巴细胞悬液+抗CD抗体致敏的RBC悬液→置室温片刻，经低速离心→移放室温1小时/4℃过夜后→重悬取样涂片染色镜检共计100~200个淋巴细胞，以花环形成细胞数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。6/6/202316第二节免疫细胞表面标志和功能的检测一、T细胞标志及功能的检测（三）T细胞功能的检测

1、T细胞增殖试验（T细胞转化试验）判断T细胞功能的一项非特异性体外免疫学检测指标。[基本原理]在体外T细胞与刺激物共育后，细胞代谢和形态相继会发生一系列的变化，在24~48h内，蛋白质和核酸合成增加，最终T细胞呈母细胞化，出现分裂增殖现象。有形态计数法和放射性核素计数法两种6/6/202317第二节免疫细胞表面标志和功能的检测一、T细胞标志及功能的检测（三）T细胞功能的检测

2、T细胞介导的细胞毒（LMC）试验评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，肿瘤患者的判断预后和观察疗效的指标之一。

（1）形态学检查法

淋巴细胞+肿瘤细胞→混合共温培养后→瑞氏染色→光镜计数残留的肿瘤细胞数，计算杀伤率。

本法不需特殊设备，操作较方便，但敏感性较差，不能确切反映细胞的损伤和死亡6/6/202318第二节免疫细胞表面标志和功能的检测一、T细胞标志及功能的检测（三）T细胞功能的检测

2、T细胞介导的细胞毒（LMC）试验（2）放射性核素法一般采用125I-UdR掺入法或51Cr释放法。

6/6/202319第二节免疫细胞表面标志和功能的检测二、B细胞标志及功能的检测（一）受体的检测

SmIg标志的检测多采用间接荧光免疫法或酶免疫组织化学法（二）表面抗原的检测用相应的CD系列单抗，用荧光免疫、酶免疫组织化学技术加以检测CDl9、CD20、CD22、CD27等抗原6/6/202320第二节免疫细胞表面标志和功能的检测二、B细胞标志及功能的检测（三）B细胞功能的检测1、血清中免疫球蛋白含量测定检测方法：琼脂单向扩散试验，方法较粗糙；现用ICS仪作自动速率散射比浊法，迅速可靠。6/6/2023216/6/202322第二节免疫细胞表面标志和功能的检测二、B细胞标志及功能的检测（三）B细胞功能的检测

2、细胞产生抗体能力的体外试验检测B细胞体外产生抗体的能力，不仅可以了解B细胞功能，还可研究B细胞分化增殖所需的条件，以及T细胞和巨噬细胞等与B细胞相互作用的调节机制。

6/6/202323第二节免疫细胞表面标志和功能的检测二、B细胞标志及功能的检测（三）B细胞功能的检测

2、细胞产生抗体能力的体外试验（1）溶血空斑技术又称空斑形成细胞试验[基本原理]用SRBC免疫动物不同天数后，取脾脏制成细胞悬液。将其与SRBC在半固体琼脂凝胶内混合，倾注于平皿或玻片上使成薄层，置37℃温育。抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，后者与周围SRBC结合使补体活化而产生溶血，在细胞周围形成一个肉眼可见的透明溶血区，称为溶血斑。每个空斑表示一个抗体生成细胞。6/6/2023246/6/202325第二节免疫细胞表面标志和功能的检测三、NK细胞活性的检测（一）NK细胞活性检测的方法

1、形态学检测法[基本原理]将效-靶细胞按一定比例混合共温后，用台盼蓝、伊红丫等（活细胞拒染）染料染色，分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，由此推算NK细胞的杀伤活性。用台盼蓝染色，须在3min内完成计数，否则活细胞也将开始摄取染料而着染。伊红丫染色在1~10min内，死、活细胞比例不变。本法简便易于掌握，但主观因素较大，也无法计出遭轻微损伤的细胞。6/6/202326第二节免疫细胞表面标志和功能的检测三、NK细胞活性的检测（一）NK细胞活性检测的方法

2、酶释放检测法[基本原理]将效-靶细胞共育一段时间后，根据靶细胞破坏后释放的酶量推断死亡的细胞数。通常以乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶为检测指标。取共育后离心的上清液，加酶底物显色。根据光密度的变化确定酶含量的多少。[特点]经济、快速、简便，可定量。[影响因素]有培养液、pH、温度以及终止反应的时间等。实际操作时要严格掌握条件6/6/202327第二节免疫细胞表面标志和功能的检测三、NK细胞活性的检测（二）NK细胞活性检测的临床意义临床的辅助诊断以及判断预后，考核疗效6/6/202328第二节免疫细胞表面标志和功能的检测四、吞噬细胞检测技术（一）中性粒细胞的检测

中性粒细胞的检测包括数量、细胞运动功能以及吞噬和杀菌功能的检测。1、中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测受检细胞悬液内按一定比例加入活的白色念珠菌悬液，混合保温后，加亚甲蓝(美蓝)溶液作活体染色，取样涂片作光镜检查。如胞内白色念珠菌呈蓝色，表示该菌已被杀死，共计100~200个细胞，分别求其吞噬率①和杀菌率②。6/6/202329第二节免疫细胞表面标志和功能的检测四、吞噬细胞检测技术（一）中性粒细胞的检测

中性粒细胞的检测包括数量、细胞运动功能以及吞噬和杀菌功能的检测。1、中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测正常情况下，对大肠杆菌的杀菌率＞90％，对金黄色葡萄球菌的杀菌率＞85％

6/6/202330第二节免疫细胞表面标志和功能的检测四、吞噬细胞检测技术（二）巨噬细胞功能的检测巨噬细胞功能的检测包括有炭粒廓清试验、吞噬功能检测、溶酶体酶的测定、巨噬细胞促凝血活性测定，以及分泌功能和表面标志检测等。6/6/202331第二节免疫细胞表面标志和功能的