聚合酶链反应及其相关技术

聚合酶链反应于1983年由美国Cetus公司K.Mullis博士建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。当前第1页\共有97页\编于星期五\11点PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平

简便、快速

2～4小时完成扩增对标本的纯度要求相对较低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板当前第2页\共有97页\编于星期五\11点一、PCR反应原理和反应过程AmplificationofDNAinvitroincluding:变性（denaturation）:94C~95C

退火（annealing）:40C~70C

延伸（extension）:72C

三个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。当前第3页\共有97页\编于星期五\11点当前第4页\共有97页\编于星期五\11点当前第5页\共有97页\编于星期五\11点二、PCR的反应体系和反应条件PCR反应体系参与PCR反应的主要成份(principlecomponents):Template、Primers、dNTPTaqDNApolymeraseBuffer当前第6页\共有97页\编于星期五\11点模板(Template)基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等RNA作为模板时，须先将RNA逆转录cDNA，再以cDNA作为扩增的模板模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng当前第7页\共有97页\编于星期五\11点引物（Primers)

引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循相关原则当前第8页\共有97页\编于星期五\11点设计引物的原则二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18~25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡引物退火温度计算：Tm℃=2(A+T)+4(C+G)引物的5’端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）引物浓度：0.1~0.2mol/L,浓度过高容易生成引物二聚体当前第9页\共有97页\编于星期五\11点Tmisdefinedasthetemperature

atwhich

halfthemoleculesaresingle-stranded当前第10页\共有97页\编于星期五\11点当前第11页\共有97页\编于星期五\11点当前第12页\共有97页\编于星期五\11点Effectof%GCContentonTm当前第13页\共有97页\编于星期五\11点Effectof[Salt]onTm当前第14页\共有97页\编于星期五\11点脱氧核苷三磷酸（dNTP）

dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20~200mol/L,浓度升高增加非特异性扩增当前第15页\共有97页\编于星期五\11点DNA聚合酶(DNApolymerase)从一种生活在热泉水（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性Taq酶的作用:在模板指引下以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成最适酶量：1~2.5U（酶量过多导致非特异性扩增）当前第16页\共有97页\编于星期五\11点TaqDNA聚合酶复制的保真性：TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增片段越长，错配的机率越高当前第17页\共有97页\编于星期五\11点耐热的

DNA多聚酶PwoDNApolymerase、TthDNApolymerase、PfuDNApolymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2~10倍当前第18页\共有97页\编于星期五\11点镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于稳定反应系统、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性有直接影响虽然Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性当dNTP浓度为200mol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。当前第19页\共有97页\编于星期五\11点其它反应因素

pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq酶的活性）当前第20页\共有97页\编于星期五\11点PCR的反应条件

反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）当前第21页\共有97页\编于星期五\11点温度

变性温度：94℃~97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右温度过高降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72℃

此时Taq酶具有较高的酶促活性当前第22页\共有97页\编于星期五\11点时间

第一次变性应给予足够时间（5~7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~1分钟，时间过长易导致非特异性扩增当前第23页\共有97页\编于星期五\11点循环次数

重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上PCR反应产物呈指数性增长，但在扩增25~35个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长当前第24页\共有97页\编于星期五\11点指数增长期平台期循环数#

理论值

实际值Log产物DNAPCR的扩增过程当前第25页\共有97页\编于星期五\11点平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等当前第26页\共有97页\编于星期五\11点以PCR为基础的相关技术当前第27页\共有97页\编于星期五\11点以PCR为基础的相关技术逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)定量PCR(quantitativePCR)实时PCR(realtimePCR)多重PCR(multiplexPCR)免疫PCRPCR诱导定点突变原位PCR(insituPCR)当前第28页\共有97页\编于星期五\11点逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针检测RNA病毒、分析基因表达等当前第29页\共有97页\编于星期五\11点逆转录生成cDNA方式以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3’末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增当前第30页\共有97页\编于星期五\11点当前第31页\共有97页\编于星期五\11点定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统（相对定量），因为多种因素会影响最终产物量内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因，如-肌球蛋白基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)等当前第32页\共有97页\编于星期五\11点相对定量PCR通过凝胶电泳分析靶基因和内参照的PCR产物量，实现对样本中靶基因的相对定量内参照基因一般选择与靶基因序列无关的“管家基因”

这些基因的含量相对丰富，转录比较稳定当前第33页\共有97页\编于星期五\11点

相对定量PCR设计相对定量PCR实验方案时须注意：预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所采用的各反应参数在扩增指数范围内，避免平台效应当前第34页\共有97页\编于星期五\11点相对定量RT-PCR将RNA逆转录为cDNA靶基因与“管家基因”同管扩增PCR产物的凝胶电泳分析当前第35页\共有97页\编于星期五\11点不同模板量时线性扩增循环数的确定模板量62.5~250ng时，27个循环内为线性扩增反应期当前第36页\共有97页\编于星期五\11点不同循环次数时模板量的确定

62.5~250ng模板量至27个循环内为线性扩增当前第37页\共有97页\编于星期五\11点相对定量PCR管家基因与靶基因扩增产物的长度应不同，以使电泳能将两者分离开分别扫描管家基因和靶基因的条带密度，二者之比即为靶基因扩增条带的相对密度分析各靶基因相对密度的变化当前第38页\共有97页\编于星期五\11点B-actin相对定量PCR当前第39页\共有97页\编于星期五\11点

相对定量PCR的优势与不足不需要特殊的检测设备和试剂即可以对靶基因进行相对定量内对照系统无法排除参照基因本身表达变化的影响及参照基因和靶基因两者扩增效率不同等因素对实验结果的干扰当前第40页\共有97页\编于星期五\11点对核酸扩增反应进行直接和动态监测，实现对靶基因的实时定量分析实时PCR（realtimePCR）当前第41页\共有97页\编于星期五\11点荧光定量PCRfluorescencequantitativePCR,FQ-PCR是一种实时PCR，通过监测荧光信号对PCR过程中产物量进行实时检测，计算出PCR的初始模板量当前第42页\共有97页\编于星期五\11点技术原理DNA交联荧光染料技术基于荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）技术当前第43页\共有97页\编于星期五\11点DNA交联荧光染料技术在PCR反应体系中加入SYBRGreenI染料，该染料能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光，结合的荧光信号和DNA含量成正比荧光信号的检测在每一个循环的延伸期完成后进行成本较低，无须对引物或探针进行预先的荧光标记，适用于任何反应体系特异性不高，染料分子也会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中当前第44页\共有97页\编于星期五\11点FRET技术水解探针技术(hydrolizationprobe)技术杂交探针(hybridizationprobe)技术分子信标(molecularbeacon)技术当前第45页\共有97页\编于星期五\11点TaqManTM技术原理5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ当前第46页\共有97页\编于星期五\11点5’3’5’3’TaqManTM技术原理5’3’RQExtension

Step5’3’StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’CleavagePolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’

Detection5’3’3’QTaqR5’lR当前第47页\共有97页\编于星期五\11点当前第48页\共有97页\编于星期五\11点临床标本实时定量PCR的扩增曲线当前第49页\共有97页\编于星期五\11点

RelativeFluorescencePCR产物的终点检测当前第50页\共有97页\编于星期五\11点同一份标本作96复管的测定结果当前第51页\共有97页\编于星期五\11点Lockeyetal.(1998)Biotechniques24:744-6终点检测与实时监测的结果比较当前第52页\共有97页\编于星期五\11点CtCt值的概念

Ct值：扩增曲线与基线交叉处的循环数(可以更为客观地反映样本中靶基因的初始拷贝数)当前第53页\共有97页\编于星期五\11点定量PCR的外参照系统标准曲线的制备制备标准品并计算标准品浓度系列稀释的标准品与被检样本同时扩增仪器软件绘制标准曲线并依据被检样品的Ct值给出每一反应中靶基因的拷数当前第54页\共有97页\编于星期五\11点标准品的扩增曲线当前第55页\共有97页\编于星期五\11点r=实测数据与所得标准曲线的线性吻合度标准曲线当前第56页\共有97页\编于星期五\11点当前第57页\共有97页\编于星期五\11点实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用当前第58页\共有97页\编于星期五\11点

CEA基因在消化系统上皮腺癌，尤其是直结肠癌和胃癌中高表达，因此在肿瘤细胞内可检测到其转录本。在正常成人体内极少表达。当前第59页\共有97页\编于星期五\11点正常成人体内CEA基因表达状况当前第60页\共有97页\编于星期五\11点胃肠癌肿瘤组织中CEA基因表达状况当前第61页\共有97页\编于星期五\11点

在肿瘤发生血道转移时，外周血中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异的技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关键。当前第62页\共有97页\编于星期五\11点胃肠癌患者外周血中CEA基因表达状况当前第63页\共有97页\编于星期五\11点多重PCR(MultiplexPCR)

在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段DMD基因外显子缺失的检测当前第64页\共有97页\编于星期五\11点差异显示PCR

（differentialdisplayPCR,DD-PCR）一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异比较有效的方法之一当前第65页\共有97页\编于星期五\11点

差异显示RT-PCR(DifferentialdisplayRT-PCR)当前第66页\共有97页\编于星期五\11点PCR诱导定点突变(PCRmutagenesis)产物末端引入点突变ABABP2P1PCR用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物（末端）当前第67页\共有97页\编于星期五\11点PCR产物中间引入点突变EcoRIHindIIIIsolateproducts,mixAmplifydigest,subclonesequencePvuII当前第68页\共有97页\编于星期五\11点PCR产物中引入片段性缺失ABP1P2P3P4PCRABPCRAB当前第69页\共有97页\编于星期五\11点PCR产物的检测当前第70页\共有97页\编于星期五\11点PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等位基因特异性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide,ASO）单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）融点曲线分析（meltingcurveanalysis）序列分析当前第71页\共有97页\编于星期五\11点PCR-RFLP利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者当前第72页\共有97页\编于星期五\11点RFLP诊断镰状细胞贫血当前第73页\共有97页\编于星期五\11点当前第74页\共有97页\编于星期五\11点SouthernblotanalysisSouthern印迹杂交当前第75页\共有97页\编于星期五\11点Southernblotanalysis当前第76页\共有97页\编于星期五\11点ResultsofSouthernBlotControlTissueCancerTissueprobeEE当前第77页\共有97页\编于星期五\11点PCR-SSCP单链DNA分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA

不同顺序不同构象不同电泳行为当前第78页\共有97页\编于星期五\11点当前第79页\共有97页\编于星期五\11点当前第80页\共有97页\编于星期五\11点DGGE是一种筛查单碱基突变及多态性的方法被检DNA双链分子的解链温度因存在突变而发生改变，从而使电泳迁移率发生改变DGGE的突变检出率可达90%～100%变性梯度凝胶电泳(DGGE)当前第81页\共有97页\编于星期五\11点(-)(+)DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)当前第82页\共有97页\编于星期五\11点DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)(-)(+)LowHighDenaturant当前第83页\共有97页\编于星期五\11点当前第84页\共有97页\编于星期五\11点当前第85页\共有97页\编于星期五\11点熔点曲线分析

(meltingcurveanalysis)野生型序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线荧光染料标记的双链DNA分子或荧光标记的探针被仪器的检测系统所识别DNA分子在复性时结合荧光最强，随温度的上升荧光量逐渐降低温度升至其融点温度（Tm）时荧光量急剧下降而形成融点曲线，其波峰所在温度即代表被检DNA分子的Tm值当前第86页\共有97页\编于星期五\11点Tm值取决于DNA分子的长度和其序列中G/C碱基含量当被检片段中存在突变时，就会有不同于野生型的Tm值而呈现不同的波峰如果一个被检片段中存在一个以上的突变时，可以出现一个以上的波峰，从而可以将突变序列检测出来当前第87页\共有97页\编于星期五\11点当前第88页\共有97页\编于星期五\11点当前第89页\共有97页\编于星期五\11点高分辨率熔点分析技术

（highresolutionmelting,HRM）

温度普通熔点曲线分析中每个监测点温度升高的幅度为0.5~1.0℃，而HRM时则为0.02~0.1℃，即在同一温度变化范围内能获得更多的监测数据点，体现了“高分辨率”染料一般常用的荧光染料为非饱和染料，在反应体系中如果加入过多量会抑制PCR扩增，因此实际使用浓度未达到饱和，此时染料不足以与DNA