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文档简介
荧光显示细胞器和细胞凋亡第一页,共二十二页,编辑于2023年,星期一膜相结构细胞膜核被膜线粒体内质网高尔基体溶酶体过氧化物酶体非膜相结构细胞骨架微管微丝中间纤维核骨架,核纤层细胞结构染色质,染色体,核仁,核糖体第二页,共二十二页,编辑于2023年,星期一4人一组细胞核的荧光显示P60-62线粒体的荧光标记P70内质网的荧光标记P64-67细胞凋亡的形态学观察第三页,共二十二页,编辑于2023年,星期一常用荧光染料的激发及发射波长
FluorescentDye
Excitation(激发频谱,nm)
Emission(发射频谱,nm)
Cy2TM
489
506
GFP(RedShifted)
488
507
YO-PROTM-1
491
509
YOYOTM-1
491
509
Calcein
494
517
FITC
494
518
FluorXTM
494
519
AlexaTM488
490
520
Rhodamine110
496
520
ABI,5-FAM
494
522
OregonGreenTM500
503
522
OregonGreenTM488
496
524
RlboGreenTM
500
525
RhodamineGreenTM
502
527
Rhodamine123
507
529
MagnesiumGreenTM
506
531
CalciumGreenTM
506
533
TO-PROTM-1
514
533
TOTO®-1
514
533
ABI,JOE
520
548第四页,共二十二页,编辑于2023年,星期一FluorescentDye
Excitation(激发频谱,nm)
Emission(发射频谱,nm)BODIPY®530/550
530
550
Dil
549
565
BODIPY®TMR
542
568
BODIPY®558/568
558
568
BODIPY®564/570
564
570
Cy3TM
550
570
TRITC
547
572
MagnesiumOrangeTM
550
575
Phycoerythrin,R&B
565
575
RhodaminePhalloidin
550
575
CalciumOrangeTM
549
576
PyroninY
555
580
RhodamineB
555
580
RhodamineRedTM
570
590
Cy3.5TM
581
596
ABI,ROX
588
608
CalciumCrimsonTM
590
615第五页,共二十二页,编辑于2023年,星期一FluorescentDye
Excitation(激发频谱,nm)
Emission(发射频谱,nm)
TexasRed®
595
615
NileRed
549
628
YO-PROTM-3
612
631
YOYOTM-3
612
631
R-Phycocyanin
618
642
C-Phycocyanin
620
648
TO-PROTM-3
642
660
TOTO®-3
642
660
DiDDilC'(5)
644
665
Cy5TM
649
670
Thiadicarbocyanine
651
671
Cy5.5
675
694第六页,共二十二页,编辑于2023年,星期一1.细胞核的荧光显示P60-62
吖啶橙(AcridineOrange)
吖啶衍生物之一,它既可嵌入DNA双链间与双链DNA结合,经蓝光激发后发出亮绿色荧光,又可以静电堆积的方式与单链DNA或RNA的磷酸根结合,蓝光激发下发出橘红色荧光,从而清晰的显示DNA,RNA。异染色质(核内深染)和常染色质(核内浅染)第七页,共二十二页,编辑于2023年,星期一实验方法:P621.将生长有培养细胞的盖玻片(注意细胞面向上)置于一次性小培养皿内,加入95%乙醇固定15-30分钟,取出自然干燥;2.加入1%醋酸酸化30秒;3.在盖玻片标本上滴加0.01%吖啶橙染液,染色5-10分钟;4.去染液,用磷酸缓冲液冲洗1分钟;5.用1/10氯化钙分化30秒-3分钟;6.用PBS漂洗玻片3次,每次数秒;7.临时封片:滴1-2滴PBS于载玻片上,将含细胞的盖玻片反扣其上,置荧光显微镜下用100X物镜观察。第八页,共二十二页,编辑于2023年,星期一细胞核呈绿色(DNA),细胞质呈橙红色。第九页,共二十二页,编辑于2023年,星期一2.线粒体的荧光标记P70罗丹明123--特异性的线粒体荧光染料,是膜电位敏感的阳离子荧光素,活细胞线粒体具有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位,吸引染料并将它保持在线粒体中,经蓝光激发,呈现黄绿色荧光.可作为线粒体膜电位的灵敏指示.罗丹明123结构式第十页,共二十二页,编辑于2023年,星期一电子传递和氧化磷酸化的偶联第十一页,共二十二页,编辑于2023年,星期一实验方法:P71取出已培养好细胞的盖玻片,用PBS(+)冲洗3次,每次漂洗浸泡2--3分钟,2.加入罗丹明123标记液,37℃培养箱孵育15分钟,3.吸去标记液,PBS液洗3次,每次3--5分钟,4.临时封片:滴1-2滴缓冲液于载玻片上,将含细胞的盖玻片反扣其上,置荧光显微镜下用100X物镜观察。第十二页,共二十二页,编辑于2023年,星期一细胞核附近发绿色荧光的圆形或短杆状颗粒即为线粒体第十三页,共二十二页,编辑于2023年,星期一3.内质网的荧光标记P64-671.材料培养细胞爬片2.试剂储存液:0.5mg/mLDIO-C6(3)存储液,4℃避光,标记液:2.5ug/mLDIO-C6(3),
4℃避光。
0.5%戊二醛第十四页,共二十二页,编辑于2023年,星期一实验方法:P67取出已培养好细胞的盖玻片,用0.5%戊二醛PBS溶液固定细胞10分钟,2.吸去固定液,用PBS液洗3次,每次漂洗时浸泡
3--5分钟2.滴加DIO-C6(3)荧光染液,室温染色1分钟,3.吸去标记液,PBS液洗3次,每次5分钟,4.临时封片:滴1-2滴缓冲液于载玻片上,将含细胞的盖玻片反扣其上,置荧光显微镜下用100X物镜观察。第十五页,共二十二页,编辑于2023年,星期一第十六页,共二十二页,编辑于2023年,星期一4.细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmedcelldeath简称PCD),是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程,是一种生理性调节机制,与细胞坏死的死亡机制是完全不同。细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一,在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面,而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均具有十分重要的作用。第十七页,共二十二页,编辑于2023年,星期一第十八页,共二十二页,编辑于2023年,星期一第十九页,共二十二页,编辑于2023年,星期一凋亡(Apoptosis)坏死(Necrosis)(1)定义:一种与遗传机制有关的(即由基因调控的)主动的、自发死亡的方式,无炎症反应。外在的致损伤因素作用达到一定强度,持续一定时间后所导致的细胞死亡(被动),有炎症反应。(2)形态学观察
细胞核:核浓缩、碎裂(染色质浓缩→有规律性、断裂成核碎片),有新月形凋亡小体。细胞器:完整细胞膜:完好细胞体积:细胞浓缩在组织中:常呈单个细胞发生
核溶解(无规律的染色质团块→溶解)无规律性。崩解尚失去完整性细胞肿胀常成群细胞发生细胞凋亡与坏死的区别第二十页,共二十二页,编辑于2023年,星期一(3)、生物化学检测核DNA有规律断裂50~300kb/或180bp左右的片断凝胶电泳:呈梯形条带(ladder)DAPI萤光染色,片状、颗粒状核荧光。流式细胞仪检测:可见亚G1峰(AP峰)
核基因表达:必须
DNA酶活性:必须蛋白激酶活性:必须细胞器环境:Na+/K+泵功能完好
DNA无规律地断裂条带不清(smears)无颗粒或片状核荧光出现无此峰
——————
功能丧失第二十一页,共二十二页,编辑于2023年,星期一
细胞凋亡形态学观察荧光显微镜观察法-
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