蜡样芽孢杆菌检测

蜡样芽孢杆菌检验刘晓川中心实验室---20121128当前第1页\共有28页\编于星期五\13点GB/T4789.14-2003GB4789.14-征求意见稿检测程序错误纠正及细节修改形态观察生化试验主要修改如下：修改标准的中英文名称增加第二法MPN法更改MYP培养条件增加根状生长实验增加溶菌酶实验增加附录A、附录B当前第2页\共有28页\编于星期五\13点GB/T4789.14-2003检验程序：与6.1操作步骤不一致，此处稀释液培养不执行。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第3页\共有28页\编于星期五\13点菌数测定将原来5个稀释度调整为2-3个稀释度。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第4页\共有28页\编于星期五\13点GB4789.14-XXXX內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第5页\共有28页\编于星期五\13点附加试剂异常问题甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基异常正常

50%卵黄生产时污染微生物，平板培养后变黄，同时有异味。联系厂家换货。自行配置50%卵黄。（无菌操作，卵黄与等量灭菌生理盐水混合）內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第6页\共有28页\编于星期五\13点标准菌株蜡样芽孢杆菌标准菌株ATCC11778ATCC菌株不需要配置活化液，复溶后可直接涂抹平板。生长温度范围为20-45℃，最适生长温度为30-37℃。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第7页\共有28页\编于星期五\13点菌落形态ATCC11778产生卵磷脂酶不发酵甘露醇发酵甘露醇內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第8页\共有28页\编于星期五\13点蜡样芽孢杆菌显色培养基（海博）蜡样芽孢杆菌呈现蓝绿色，菌落较大。苏云金芽孢杆菌呈现蓝绿色。单增李斯特菌呈现深蓝色。其他菌呈现黄色或无色。G-菌抑制。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第9页\共有28页\编于星期五\13点形态观察芽孢（隐藏的生命）营养体条件合适內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第10页\共有28页\编于星期五\13点芽孢染色染液：孔雀绿+沙黄內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第11页\共有28页\编于星期五\13点芽孢在一定条件下，生长发育后期细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形（前孢子）。有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，称芽孢杆菌。另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓槌状，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌。2，6-吡啶二羧酸（DPA）內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第12页\共有28页\编于星期五\13点培养特性內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第13页\共有28页\编于星期五\13点生化性状內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第14页\共有28页\编于星期五\13点生化鉴定套装可使用陆桥或海博生化鉴定套装內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第15页\共有28页\编于星期五\13点生化试验(陆桥)柠（枸）动硝VP木明葡（厌氧）甘

-++--++-明胶、硝酸盐穿刺接种，其他滴加菌液內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第16页\共有28页\编于星期五\13点生化试验(海博)1.揭开盖板2.撕开封口膜3.标记4.制备菌液，加入试剂孔5.盖上盖板，培养后填写结果表并报告。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第17页\共有28页\编于星期五\13点明胶液化实验注意事项：1.明胶观察结果时，需放4℃,30min,而后观察结果，呈液体状态为阳性，固态为阴性。2.葡萄糖利用试验，需厌氧条件培养，变为黄色为阳性。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第18页\共有28页\编于星期五\13点过氧化氢酶实验3%过氧化氢溶液，临用前配置，用水稀释挑取单个菌落置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2ml，观察结果阳性半分钟内产生气泡阴性不产生气泡原理：过氧化氢水+氧气载玻片接触酶实验不建议将过氧化氢直接滴加于平皿上过氧化氢酶內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第19页\共有28页\编于星期五\13点溶血实验胰酪胨大豆养血（TSSB）琼脂陆桥CM136（TSSB基础）+P62（无菌脱纤维羊血）30±1℃培养24±2h，菌落浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第20页\共有28页\编于星期五\13点根状生长实验间隔0.5cm左右距离划平行直线于营养琼脂平板上，30±1℃培养24h±2h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株不具形成根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌蕈状芽胞杆菌內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第21页\共有28页\编于星期五\13点酪蛋白酶实验酪蛋白琼脂培养基成分中酪蛋白不会溶解接种可以菌落，36±1℃培养48±2h阳性菌落周围培养基出现澄清透明区，表示产生酪蛋白酶。阴性反应继续培养72h观察原理：蜡样芽孢杆菌代谢产生碱性蛋白酶，可水解酪蛋白成为小分子肽段，使菌落周围的培养基变透明。采用点种的方式接种，可以清晰的看到透明环。

內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第22页\共有28页\编于星期五\13点蛋白质毒素结晶试验步骤：1.取室温放置3d～4d的营养琼脂培养物少许涂于载玻片。2.自然干燥，微火固定，甲醇作用30s，火焰干燥.3.滴0.5％碱性复红，火焰加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持续1min～2min，移去火焰。更换染色液加温30s，水清洗、晾干后镜检。结果观察：观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体（伴孢晶体）。芽孢蛋白结晶体內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第23页\共有28页\编于星期五\13点溶菌酶耐性试验用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36℃±1℃培养24h。蜡样芽胞杆菌在本培养基(含0.001％溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。结果观察：混浊现象培养基：溶菌酶肉汤基础+溶菌酶溶液內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第24页\共有28页\编于星期五\13点蜡样芽胞杆菌生化特征与其它芽胞杆菌的区别內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第25页\共有28页\编于星期五\13点生化分型（选作）根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙內蒙PRESENTATIONTITLE&DATE20.09.09内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司INNERMONGLIAMENGNIUDAIRY(GROUP)CO.,LTD当前第26页\共有28页\编于星期五\13点淀粉酶实验

培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）+0.2%可溶性淀粉，灭菌倒板。步骤：1.接种平板，36±1℃培养18-24h；2.滴加鲁格氏碘液，阳性培养基蓝色，菌落周围有透明圈。原理：碘+淀粉