肿瘤化疗耐药性机理(肿瘤学基础)课件

肿瘤化疗耐药性机理

及肿瘤化疗敏感性检测一.肿瘤化疗耐药性(一)概述化疗作为全身性治疗的手段，在恶性肿瘤的治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。1946年Gillman和Phillips报道氮芥类药物治疗造血系统肿瘤以来，化疗已取得长足进步。50年代氟脲嘧啶、环磷酰胺，70年代顺铂的开发都成为化疗史上的里程碑，目前临床应用的抗肿瘤药物已达60余种。通过不懈的基础与临床研究，揭示了化疗的部分规律，形成了现行的联合用药、大剂量间断给药、多途径多方式给药等有助于提高疗效的治疗策略。

目前化疗已使绒癌、恶性葡萄胎、何杰金病、睾丸精原细胞瘤等获得治愈的机会，使乳腺癌、儿童淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤等得以缓解，存活期得到延长，从而化疗成为恶性肿瘤治疗的主要手段之一。但临床抗肿瘤药物治疗的总有效率仅14％。阻碍化疗取得更好疗效的原因是：1.现行化疗的盲目性、凭经验治疗：个体化治疗2.化疗的耐药性：设法防治耐药、逆转耐药性3.抗肿瘤药物的毒性：联合用药等措施(二)耐药性类型：先天性耐药(naturalresistance):肿瘤一开始就对抗肿瘤药物有耐药性，主要与药理学、生物化学和肿瘤细胞增殖动力学有关。获得性耐药(acquiredresistence)：肿瘤最初对抗肿瘤药物敏感，应用后产生的耐药性。根据耐药谱分为：原药耐药(primarydrugresistence,PDR)：只对原抗肿瘤药物产生耐药，而对其他抗肿瘤药物不产生交叉耐药。多药耐药(multipledrugresistence.MDR)：由一种抗肿瘤药物诱发，但同时又对其他多种结构和功能差异的抗肿瘤药物产生交叉耐药。(三)多药耐药产生机理：

1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)

GSH与GST密切配合启动肿瘤细胞内解毒机制而使化疗药物失活，参与耐药机理的形成。如苯丙酸氮芥、环磷酰胺、顺铂、阿霉素、丝裂霉素等。胞内GSH浓度与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽合成酶(GS)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性有关；与谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸的含量有关。

GSH含量及相关酶：GST、γ-GCS、GS、GR活性是GSH引起耐药的相关因子。具体机理：

①GST可催化GSH与亲电性抗肿瘤药物迅速结合，加速抗肿瘤药物的降解，使药物在靶部位的积蓄迅速减少，从而达不到致死浓度。②GST可催化亲脂性抗肿瘤药物与胆红素及甾体化合物等结合，加速药物的排泄，并保护膜脂质成分免受自由基等损伤。③清除细胞毒性代谢产物，如过氧化物和自由基被GSH还原成毒性较低醇类物质。④阻止药物与靶细胞DNA结合，并加强对损伤DNA的修复能力，降低抗肿瘤药物的细胞毒作用。

2.P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp):

P-gp由多药耐药基因(mdr)编码分子量为17KD，具有能量依赖性药泵跨膜糖蛋白。使ATP水解成ADP，释放能量，并在Mg2+的作用下，与细胞内抗肿瘤药物结合并运输到细胞外，P-gp可将亲脂类化疗药物泵出细胞外，也可能同时存在多种药物结合点而将多种药物泵出细胞外，引起耐药。P-gp高表达伴随预后不良，可作为肿瘤患者预后评价的指标。

P-gp也可存在许多正常组织：脑、肺、肝、肾、结肠等处。

3.多药耐药相关蛋白

(mulitidrugrelatedprotein,MRP)

分子量为19KD的能量依赖性药泵跨膜糖蛋白，MRP增高可将带负电荷药物如阿霉素、表阿霉素、Vp16、长春新碱、长春花碱、放线菌素等泵出细胞；MRP能识别并转运与GSH耦合的底物；MRP能使细胞内药物分布发生改变，使重要的攻击靶点（胞核）药物减少，从而产生耐药。

4.拓扑异构酶(topoisomerase,TOPO)

TOPO是催化DNA拓扑结构改变的酶，即引起DNA二维、三维结构改变的酶系统。它直接参与细胞的增殖，与DNA复制、转录、姊妹染色体的分离及基因的表达密切相关，可以影响细胞许多重要的生物学功能，是细胞维持正常生理活动所必需的酶。

TOPO根据其断裂DNA单链或双链而分为Ⅰ、Ⅱ。

TOPOⅠ是喜树碱、蒽环类抗肿瘤药物的重要靶点，TOPOⅡ是许多插入物、Vp16等的重要靶点。这些药物通过该酶与DNA交链形成共价复合物，引起DNA永久性损伤，导致肿瘤细胞死亡。若该酶含量减少，活性降低，复合物形成减少而产生耐药。

5.肺耐药蛋白

(lungresistancepyotein,LRP)LRP为分子量110KD穹窿蛋白（穹窿作为胞浆中的一种细胞器，所含的核糖蛋白颗粒50％为LRP）。LRP可能介导顺铂、卡铂、烷化剂等一些P-gp和MRP不能介导的药物从核到胞浆重新分布因而产生耐药。

6.二氢叶酸还原酶

(dihydrofolate

reductase,DHFR)DHFR分子量为22KD，是细胞内叶酸代谢的关键酶，能催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，四氢叶酸在胸腺嘧啶合成酶作用下参与DNA、RNA、蛋白质的合成。氨甲碟呤(MTX)是一种叶酸类似物，能竞争性地与靶酶DHFR的活性位点结合而使其失活，导致细胞内四氢叶酸含量下降，细胞DNA合成异常，引起细胞死亡。MTX产生耐药因素与DHFR基因突变有关。

7.O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶

(O6-alkylguanineDNAalkyltransferase,AGT)

AGT由甲基鸟嘌呤转移酶基因编码，AGT能修复损伤DNA，即修复许多烷化剂类抗肿瘤药物所诱导形成O6-烷基鸟嘌呤DNA加成物，因而使肿瘤细胞产生耐药。

8.醛脱氢酶(aldehydrase,ALDH)

环磷酰胺（CTX）进入人体后在肝脏内经P450羟化形成4-羟环磷酰胺，它与醛磷酰胺存在互变异构，醛磷酰胺经历一次β消除反应，形成丙烯醛与磷酰胺芥。磷酰胺芥对肿瘤细胞产生细胞毒作用，而ALDH能将醛磷酰胺氧化成无毒性的羧基磷酰氨，不对肿瘤细胞产生细胞毒作用，从而出现肿瘤细胞耐药。

9.蛋白激酶C(protrinkinaseC,PKC)

PKC是一种Ca2+、磷脂依赖性蛋白质激酶，使多种蛋白质的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化，影响细胞内生物信息的传导，在调节细胞代谢、分化、增殖、癌变中具有重要作用。在MDR细胞中加入维拉帕米、三氟拉嗪，细胞内PKC活性降低50％，MDR出现完全或部分逆转。

PKC在MDR中的机理是增加P-gp的磷酸化，而P-gp磷酸化是其依赖ATP向细胞外转运药物的必要条件。用PKC抑制剂H7可使P-gp磷酸化程度降低30％；用PKC激活剂可加速P-gp磷酸化。10.凋亡基因失活与抗凋亡基因激活

凋亡基因bax、bcl-Xs、p53等失活；抗凋亡基因bcl-2、bcl-Xl、ber/abl等激活，Bcl-2蛋白过表达可通过抑制P53蛋白活性、抑制c-myc诱导的凋亡、与Bax蛋白形成异二聚体等途径导致肿瘤细胞对许多化疗药物诱导的凋亡不敏感，参与肿瘤细胞多药耐药。(四)多药耐药模型的建立

1.体外耐药细胞系的建立：药物浓度递增持续作用法、大剂量药物间歇诱导法、采用转基因方法。

2.体内耐药细胞系的建立：(五)耐药株细胞检测1.细胞形态变化：光镜、电镜观察2.细胞生长曲线：计算群体倍增时间3.耐药指数：耐药株IC50/亲代株IC504.细胞染色体检测：染色体均匀染色区、双微核。5.免疫细胞化学法：P-gp、MRP、GST-π、bcl-2等。6.细胞内酶的测定：O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶、谷胱甘肽和谷胱甘肽-S-转移酶测定7,流式细胞仪测定：P-gp、bcl-2等及细胞周期分布8.细胞内药物浓度测定：用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定细胞内铂、阿霉素等浓度。9.多药耐药基因mRNA的检测：PCR、Northern印迹分析、原位杂交等。10.耐药株稳定性测定：细胞冻存与复苏二抗癌药物敏感试验

(anti-cancerdrugsensitivitytest)(一)分类

1.体内法：鸡胚接种移植法、动物眼前房移植法、裸鼠及标准动物的肾包膜下移植法等。它们不脱离肿瘤生长的体内环境、在组织学和细胞动力学方面都与人体肿瘤内一致，因而使试验结果与临床的符合率高。

2.体外法：人癌干细胞克隆形成测定法（HTCA）、四唑氮蓝显色反应法（MTT法）、同位素掺入法、ATP生物发光法、琥珀酸脱氢酶抑制法、染料排除法、流式细胞仪法、PCR法等。它们具有快速、简便、与临床相关性好、重复性好等优点。

(二)四唑氮蓝显色反应药敏试验（MTT法）

1.原理：利用活细胞内线粒体脱氢酶能将MTT转化为蓝紫色衍生物(formazan)的原理来检测活细胞数目。产物颜色深浅（可用吸光值表示）与活细胞数成正比，吸光值可以在自动酶标仪上连续记数，测定出肿瘤细胞未用药与用药的吸光值，计算出肿瘤细胞存活率，从而预测患者体内肿瘤细胞对某种抗肿瘤药物敏感程度。2.方法：计算：实验组吸光值肿瘤细胞存活率＝肿瘤细胞对照组吸光值肿瘤细胞抑制率＝1－肿瘤细胞存活率结果判定：肿瘤细胞抑制率>70％该药高度敏感肿瘤细胞抑制率50－70％该药中度敏感肿瘤细胞抑制率<50％该药不敏感应用：肿瘤患者个体化治疗中的作用：实体瘤、胸腹水、骨髓血、外周血等。其他方面应用：逆转耐药测试，筛选新抗治疗药物（抗癌谱、半致死量等），其他细胞毒作用的药物如细胞因子、反义核苷酸的作用检测，新合成人类替代材料对正常细胞的毒性作用。影响因素及注意事项：1.肿瘤细胞的病理类型2.肿瘤标本取材部位3.肿瘤标本污染4.肿瘤细胞纯