酶的发酵生产

酶的发酵生产第一页，共三十五页，编辑于2023年，星期二本章内容3.1概述3.2酶生物合成的基本原理3.3发酵工艺条件及控制3.4微生物细胞发酵产酶及提高发酵产酶量的方法3.5动植物细胞培养产酶2第二页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.1概述3第三页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.1.1酶的合成途径化学合成，包括酶的化学全合成、酶类似物和模拟酶的化学合成。1964年我国从氨基酸出发，以化学方法全合成了具有生物活性的胰岛素，1969年Gutte和Merrifield也通过化学法人工合成了具有活性的核糖核酸酶，现在已发展了一整套固相合成肽的自动化技术。生物合成，在一定的条件下通过生物体、生物组织或细胞内的代谢合成所需的酶。包括微生物、动植物及组织和细胞等。当前绝大部分的酶是通过此方法合成的。4第四页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.1.2现有酶生产主要方法酶制剂工业的发展早期，酶多取自动植物原料。单动植物的生长周期长、同时还受地理、气候和季节等各种因素的限制，不适于大规模工业生产。近年酶的生产几乎都转向采用微生物发酵，主要具有以下优点：种类繁多，凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找到，并可根据应用特点和要求，筛选出最佳的产酶菌株。繁殖快，发酵周期短，培养简单，能通过控制培养条件大幅提高酶的产量。微生物具有较强的适用能力，可采用遗传变异手段，培育出新的、更理想菌株，和对酶进行改进和修饰。5第五页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.1.3微生物发酵产酶的生产方式固体培养发酵以麸皮、米糠等为主要原料，加入其它必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发酵，以获得所需的酶。适合霉菌的培养和发酵产酶，以及制作酒曲、酱油曲等。液体深层发酵采用液体培养基，在生物反应器中，经灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下进行发酵，生产得到所需酶。酶的产率高，质量稳定，产品回收率高，是目前酶发酵的生产的主要方式。固定化细胞发酵20世纪70年代后发展的技术，把微生物固定在水不溶性的载体上，进行多批次连续或间歇发酵。这种发酵具有：细胞密度大，产酶能力高；发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长时间；细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率条件下连续发酵；发酵液含菌体少，利于产品分离。6第六页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.2酶生物合成的基本原理7第七页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.2.1酶生物合成的基本过程1958年克里克(Crick)提出了中心法则，认为蛋白质的合成主要是按以下过程进行：

转录翻译蛋白质DNARNA8第八页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.2.2RNA的生物合成——转录转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在依赖DNA的RNA聚合酶(又称转录酶)的作用下，生成RNA。转录包括3个步骤：转录的起始、RNA链的延伸和RNA链合成的终止。在原核和真核生物中，除了转录酶、转录的调节以及转录后RNA前体的加工外，转录过程大致相同。9第九页，共三十五页，编辑于2023年，星期二转录的起始RNA的生物合成的起始位点是在DNA的启动基因(启动子)上，识别启动基因的任务由σ因子完成，带有σ因子的全酶与DNA分子的启动基因结合，选择一条链为模板开始合成，之后由核心酶进行RNA的延伸。转录起始阶段的过程如下：核心酶与σ因子结合成为全酶。全酶与模板DNA结合生成不稳定的复合物，全酶可沿着模板DNA移动，寻找识别位点。全酶与启动基因结合生产酶与启动基因的复合物。模板DNA局部变性，DNA的双螺旋部分解链。全酶移至转录起点，生产稳定的酶-DNA复合物，按碱基互补结合第一个核苷三磷酸，转录正式开始，σ因子释放。10第十页，共三十五页，编辑于2023年，星期二11第十一页，共三十五页，编辑于2023年，星期二12第十二页，共三十五页，编辑于2023年，星期二13第十三页，共三十五页，编辑于2023年，星期二14第十四页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.2.3酶蛋白的生物合成——翻译翻译：以mRNA为模板，利用各种氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。是将mRNA分子上的碱基排列次序转变为多肽链上氨基酸排列次序的过程。基本过程包括：氨基酸活化肽链合成的起始肽链的延伸肽链合成的终止新生肽链的加工15第十五页，共三十五页，编辑于2023年，星期二氨基酸活化生产氨酰-tRNA氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的催化作用下，由ATP提供能量，与特定的tRNA结合生成氨酰-tRNA，AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi对真核生物，肽链的第一个氨基酸为甲硫氨酸活化后为Met-tRNAMet，原核生物主要是甲酰甲硫氨酸活化后为fMet-tRNAF。16第十六页，共三十五页，编辑于2023年，星期二肽链合成的起始原核生物肽链的起始阶段是在GTP和起始因子(Initiationfactor)的参入下，核糖体30S亚基、fMet-tRNAF、mRNA和50S亚基结合，组成起始复合物的过程。30S亚基先与mRNA结合，再与fMet-tRNAF结合，最后与50S亚基生产70S核糖体真核生物与原核生物稍有差别，主要是起始氨基酸为Met-tRNAMet

，40S亚基先与Met-tRNAMet结合，再与mRNA结合，最后与60S亚基结合生成80S核糖体。17第十七页，共三十五页，编辑于2023年，星期二18第十八页，共三十五页，编辑于2023年，星期二合成过程19第十九页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.3发酵工艺条件及控制20第二十页，共三十五页，编辑于2023年，星期二发酵产酶的工艺过程保藏菌种细胞活化细胞扩大培养固定化细胞原生质体发酵固定化原生质体预培养分离纯化酶培养基无菌空气工艺条件的控制在发酵过程中有详细的介绍21第二十一页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.4酶合成的调控及提高发酵产酶量的方法22第二十二页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.4.1酶合成的调控机制酶的产量受其合成调节机制的控制，要大幅度提高酶产量就必须设法打破这种调节机制。酶和其他蛋白质一样，其合成可在复制、转录和翻译等各种水平上进行调节控制。对于原核生物，由于其转录和翻译过程紧密关联，因此，只要控制转录，也就可控制酶的合成。其调控机制普遍接受的是操纵子模型。23第二十三页，共三十五页，编辑于2023年，星期二原核生物操纵子及其调节操纵子(Operon)包括两部分：一是荷载着有关酶的结构密码，决定酶的结构和性质的结构基因；另一是由操纵基因和启动基因等组成的调控基因。操纵基因在操纵子中起开关的作用，当开关“开启”时，附着在启动基因上依赖于DNA的RNA聚合酶(DDRP)就能通过这一开关，沿着结构基因移动，并以结构基因为模板进行转录，合成mRNA；而后再转入翻译合成有关蛋白质和酶。反之操纵基因“关闭”时，DDRP移动受阻，无法进行转录，及后续合成。24第二十四页，共三十五页，编辑于2023年，星期二原核生物操纵子及其调节操纵基因的开、关受调节基因控制，调节基因编码调节蛋白(因大多表现阻碍作用，又叫阻碍蛋白)。在一些酶的合成调节中，阻碍蛋白直接和操纵基因结合，阻碍转录的进行；而另一些酶的合成调节机制中，阻碍蛋白不能直接与操纵基因结合，只有在相应效应物存在下形成阻碍蛋白-效应物络合物，才能与操纵子结合，使之关闭。调节方式有：诱导和阻碍。25第二十五页，共三十五页，编辑于2023年，星期二操纵子大肠杆菌操纵子示意图26第二十六页，共三十五页，编辑于2023年，星期二诱导调节某些酶在通常情况下不合成或合成甚少，但加入“诱导物(Inducer)”后，就能大量合成，这种现象称为诱导(Induction)。诱导机制：调节系统中调节基因编码的调节蛋白(阻碍蛋白)是一类别构蛋白。一方面能直接和操纵基因结合，阻碍酶的合成；另一方面，它们也能和诱导物结合，结合后构象发生改变，失去和操纵基因结合的能力，使“开关”打开。加入诱导物时能诱导酶大量合成。参入分解代谢的酶，如淀粉酶、纤维素酶等受这种方式调节。27第二十七页，共三十五页，编辑于2023年，星期二阻碍调节阻碍有两种类型：尾产物(反馈)阻碍和分解代谢产物阻碍。尾产物阻碍是指在生物的生长发育过程中，原以一定速度合成的某些酶，当这些酶催化生产的产物累积到某种浓度水平并能满足需要时，这些酶的合成就会受到阻碍，这就是尾产物阻碍(反馈阻碍)。尾产物阻碍的机制可能是阻碍蛋白本身没有和操纵基因结合的能力，因而在通常情况下不会构成阻碍；但，这种阻碍蛋白能以酶反应的尾产物为效应物，即辅阻碍物，与之结合，产生别构效应，形成能和操纵基因结合的阻碍蛋白-尾产物络合物，阻碍酶的合成。28第二十八页，共三十五页，编辑于2023年，星期二阻碍调节分解代谢产物阻碍是指有些酶，特别是参与分解代谢的酶，当细胞在容易被利用的营养成分(如葡萄糖)上生长时，其合成受到的阻碍。分解代谢产物阻碍的机制较复杂，原因之一可能和启动基因与DDRP的结合有关。29第二十九页，共三十五页，编辑于2023年，星期二3.4.2提高酶产量的方法酶合成调节结构的作用是生物机体将体内的合成原料与能量最经济有效地用于合成生命最需要的物质的保证。但，从应用的目的出发，则应打破这种调节控制，以其使某些酶的产量大幅度地提高。现已报道，在采取相应的措施后，其产量可有上千倍的变化。打破这种调节可从内外两方面入手：条件控制：如添加诱导物、降低阻碍物浓度遗传控制：如基因突变、基因重组30第三十页，共三十五页，编辑于2023年，星期二通过添加诱导物提高酶产量这种办法仅适用于可诱导的酶类，但产生的效果有时十分显著，其关键在于选择适宜的诱导物和诱导物浓度。最初认为底物是首选的诱导物。现在的认识是，强有力的诱导物首先是那些难以代谢的底物类似物。异丙基-b-D-巯基半乳糖（IPTG），是半乳糖苷酶的极好诱导物。其次也可以是底物或诱导物的前体，如犬尿氨酸虽能诱导犬尿氨酸酶，但它的前——体色氨酸的诱导效果更佳。诱导物的浓度对诱导有重要的影响，在诱导作用范围内，酶的诱导生成速度正比于诱导物的浓度直至饱和值，当进一步升高有可能就会其阻碍作用。如纤维二糖的浓度维持在0.05mg/ml以下可大量诱导纤维素酶的形成，当浓度升高100倍，纤维素酶就会显著受到阻碍。31第三十一页，共三十五页，编辑于2023年，星期二通过降低阻碍物浓度提高酶产量阻碍可由分解代谢产物引起，也可因酶反应的尾产物积累而产生，因此控制二种产物的生产与积累常可提高酶产量。通用的原则是，应避免采用过于丰富的培养基和避免使用易被利用的碳源；并设法阻止效应物的形成，降低培养基中效应物的浓度。对受分解代谢产物阻碍的酶，限制碳源或相应生长因子的供应尤为重要。如以缓慢速度添加多聚半乳糖醛酸，并限制其它碳源的供应，可使液化气单孢菌生产多聚半乳糖醛酸消去酶产量提高近千倍。对于合成代谢的酶，解决尾产物阻碍的方法为：在培养基中添加阻止尾产物形成的抑制剂；采用营养缺陷型突变菌株。32第三十二页，共三十五页，编辑于2023年，星期二通过基因突变提高酶产量基因突变可发生在结构基因上，也可发生在操纵子上。前者导致酶的结构和性质的改变，而后者可引起酶产量的升高或降低。根据酶合成调节机制，基因突变后有两种情况可提高酶的产量：从诱导型转变为组成型，即获得的突变株在没有诱导物存在条件下，酶产量也能达到诱导的水平，这种突变称为“组成型突变”阻碍型转变为去阻碍型，这种情况下，突变株在通常引起阻碍的条件下，酶产量也能达到没有阻碍的水平。33第三十三页，共三十五页，编辑于2023年，星期二通过基因突变提高酶产量诱变的方法：物理方法，如紫外、g-射线、快中子辐射。作用是直接引起核酸分子脱氧核苷酸，特别是C、T氧化，造成DNA损伤和畸变。化学方法：a.5-溴尿嘧啶等，通过参入到DNA中引起突变；b.亚硝胍等，直接和DNA中的A、C、G反应而引起突变；c.吖啶黄染料等，引起DNA链中脱