荧光分光光度法课件

吸收发射第十一章荧光分析法1、光致发光现象:激发态电子回到低能级而伴随光的辐射11.1概述热辐射光辐射hν+基态→激发态→基态磷光荧光分子荧光原子荧光UV荧光X-射线荧光原子荧光光致发光的分类：光光源2荧光分析法：利用物质的荧光谱线波长和强度进行定性定量分析方法。b选择性好;但应用不如UV广泛3特点:a灵敏度比UV高,检测限10-10~10-12g/ml荧光:物质分子在激发态最低振动能级返回到基态各振动能级时所发射出的光③TLC定性、定量4应用：①物质荧光光度法定性定量②作为HPLC的检测器11.2基本原理如:π电子跃迁1、分子的能级和电子能级的多重性:π激发态π*分子能级=电子能级+振动能级+转动能级基态π11.2.1分子荧光光谱的产生自旋量子数S:001多重性M=2S+1:113状态描述:单重S单重态S三重态T能量:E1,ε1>

E2,ε2

寿命:10-8秒1秒跃迁几率:1061单重激发态三重激发态单重S*和三重T*激发态的比较S0V4V1V0V3V2（b）(a)(d)（b）V0V0S1*S2*V0V1V1V1V2V2V2V3V3V3V4V4V4(c)(e)T1*(f)e体系间跨越a吸收b振动弛豫c内部能量转换d荧光2、荧光的产生f磷光(1)振动弛豫：非辐射热释放10-12秒(2)内部能量的转移(3)荧光发射特点：荧光的能量小于激发光能量。荧光发射所需时间为10-9~10-7s。(4)外部能量的转移(碰撞热)---荧光淬灭(熄灭)特点:降低荧光强度。预防:黏度↗

,温度↘

(5)体系间的跨越:S→T降低荧光强度发生条件(1)结构含有重原子如Br、I等,

(2)溶剂中有顺磁性物质如O2(6)磷光：经过体系间跨越的分子降至三线态最低能级，跃迁至基态而发生的光。基态→S1*→弛豫→跨越→T1*→T1V=0*

→基态荧光\磷光产生过程：磷光基态→S2*→弛豫→跨越→S1*→S1V=0*→基态荧光1.荧光光谱(发射光谱):激发波长λex和I0强度一定。F~λem单色器I0λexI表面吸光物质单色器检测器λem二、激发光谱与荧光光谱(1)不同强度的光照射物质所产生的荧光光谱形状是否相同？(2)不同波长的光照射物质所产生的荧光光谱是否相同？答:光谱形状相同,强度I0和波长λex影响荧光强度2、激发光谱：荧光λem不变;F~λeXFλ特征:(1)stokes位移：λem>λex说明在激发和发射之间存在一定的能量损失。产生原因：振动驰豫、内转换

(2)荧光光谱的形状与激发波长无关(4)荧光光谱与激发光谱相似---镜像?如:蒽的光谱和激发(3)荧光强度与激发光波长有关1、物质产生荧光的必要条件A强吸光结构，共轭π—π*B高荧光效率。荧光效率(φf)=发射荧光的光子数吸收激发光的光子数11.2.3荧光与分子结构的关系2、分子结构与荧光效率的关系A长的共轭结构例激发光205nm286nm356nm荧光278nm321nm404nm荧光效率0.110.290.36B

分子的刚性和共平面性荧光效率：0.21.08-羟基喹啉8-羟基喹啉镁1-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐C取代基：①给电子基团使荧光效率增大，如-OH、-OCH3、-NH2等。②吸电子基团使荧光效率减少，如-COOH、-NO2、-X。③中性基团对荧光效率影响不大。如-R、NH3+等。12.2.4影响荧光的外界因素1、溶剂

A溶剂的极性：极性越大，λem增大，荧光效率也增强。通常选择极性溶剂。B粘度：粘度系数越大,有利于荧光效率的提高2、温度温度↗，碰撞机率↗，效率↘。热淬灭3、pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而使其荧光效率受到影响。分子状态最强4、荧光熄灭剂：OH-H+OH-H+①碰撞熄灭②化学反应淬灭③

体系间跨越引起荧光熄灭的形式：自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生5、散射光的影响引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液内微粒，溶液内气泡。散射类别：a瑞利散射:波长不变,方向改变b拉曼散射:波长变化散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定有干扰，使其读数增大。荧光光谱散射光谱溶剂λex248313365405436水271350416469511乙醇267344409459500环已烷267344408458499四氯化碳—320375418450氯仿—346410461502不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长如何提高检测精度(1)改善散射光因素影响：溶液透明，选择合适测定波长。(2)选择合适的溶剂如水。？定量IF溶液的荧光一般在与激发光源垂直的方向观察荧光Io4.3定性、定量分析荧光定性：依据激发光谱和荧光光谱。当ECl<0.05时，可得低浓度时，F~C线性关系。ECl>0.05，F~C偏离线性关系定量分析方法：1工作曲线法2比例法**标准溶液对仪器校正I0方法:标准组分的空白液调F0=0;标准硫酸奎宁液调F=50或100,测定各标准液的F,以F为纵坐标,组分浓度C为横坐标作图回归直线.**如空白液无法调F0=0,则以(Fi-F0)~C作图回归1、灵敏度高(10-9~10-12):荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度。F与原光强度I0有关荧光分光光度法特点：2、光源要求稳定：氙灯或激光二、仪器分类：滤光片荧光计、滤光片-单色器荧光计、荧光分光光度计单色器I0λexI表面吸光物质单色器检测器λem§4应用（在中药）1、自身发射荧光:分离—检测HPLC:荧光检测器TLC:365,254nm激发2、荧光淬灭:分离—检测

TLC硅胶GF2543、制备荧光衍生物无荧光有荧光淫羊藿苷+SLS荧光检测十二烷基磺酸钠如何创造较强荧光是现代荧光分析研究的方向不同物质的荧光测定法1、自身有荧光的物质直接测定多环芳烃/霉菌毒素/色素和核蛋白(卟啉类)/生物碱：喹啉类、异喹啉类、吲哚类维生素：A、B2、B6药物：激素、抗菌素、喋啶类、吡啶、哌啶类、芳酸芳酯2、较弱荧光物质较弱荧光物质可通过与荧光增强剂反应后，再进行测定。(1)荧光增强剂：防荧光猝灭a.环糊精(pH<12)b.表面活性剂:十二烷基磺酸钠;氯化十六烷基三甲铵;胆酸钠c.高沸高粘液体：tritonX-100氯仿液、>C10石蜡烃已烷液、甘油、二甲亚砜、淀粉液、三乙醇胺等。d.挥发酸(硝酸,甲酸,乙酸,盐酸);挥发碱(氨、二乙胺、乙二胺)3、非荧光物质的荧光衍生化1)荧光衍生化试剂(条件温和、衍生物稳定、易分离、不具荧光)丹磺酰氯及类似物：胺、氨基酸、羟基化合物、醛酮酸硫醇等的衍生化分离和测定。用荧光增强剂增强与保护。λex350nm、λem500nm丹磺肼：醛、酮、还原糖的测定λex350nm、λem500nm荧光胺：伯胺、氨基酸、肽及潜在伯胺基化合物

λex390nm、λem475nm手性荧光化试剂：苯托芬BOP-Cl:S