分子生物学技术之DNA重组技术

第五章分子生物学技术DNA重组技术及应用现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的重大事件三大成就：一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。（二）基因克隆的载体

我们知道仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还远远不能满足基因工程的要求，因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力，只有将他们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。载体（vector)是指具备自主复制的DNA分子，象病毒、噬菌体和质粒等相对分子量较小的复制子均可以作为基因导入的载体。载体三要素：自我复制能力；携带外源基因片段大小（具有较小的分子量和较高的拷贝数）；插入位点多少（具有若干限制酶单一识别位点）；易于鉴定识别（具有抗菌素抗性基因）大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。

大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。AmpR优点是具有较小的分子量，其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。4、pUC质粒载体（包括四个部分）：(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ’基因；(iv)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏了lacZ’基因的功能。优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。5、

pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因。含有两个噬菌体启动子（T7和SP6），为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。6、穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增，能在原核和真核细胞之间往返穿梭，具有广泛的用途。7、pBluescript噬菌粒载体pBluescript是指由Stratagene公司发展的一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链DNA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记；(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。LacZ编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的α-肽，IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶相互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使生长于含X-gal培养基中的转化菌落呈蓝色。重组DNA操作过程示意图图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体

仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。

图5-3重组DNA操作过程示意图

《化妆品术语》起草情况汇报中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所一、标准的立项和下达时间2006年卫生部政法司要求各标委会都要建立自己的术语标准。1ONE二、标准经费标准研制经费：3.8万三、标准的立项意义术语标准有利于行业间技术交流、提高标准一致性、消除贸易误差，作为标准体系中的基础标准，术语标准在各个领域的标准体系中均起着重要的作用。随着我国化妆品卫生标准体系建设逐步加快，所涉及的术语和定义的数量也在迅速增长，在此情形下，化妆品术语标准的制定就显得尤为重要。四、标准的制订原则1.合法性遵守《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监督条例实施细则》中关于化妆品的定义。2.协调性直接引用或修改采用的方式，与相关标准中的术语和定义相协调。3.科学性对于没有国标或定义不统一的术语，在定义时体现科学性的原则。4.实用性在标准体系中出现频率较高，与行业联系较紧密的术语优先选用。五、标准的起草经过

第一阶段：资料搜集

搜集国内外相关法规、标准、文献并对国外文献如美国21CFR进行翻译。第二阶段：2007年末形成初稿

初稿内容包括一般术语、卫生化学术语、毒理学术语、微生物术语、产品术语、人体安全和功效评价术语，常用英文成份术语等７部分。第三阶段：专家统稿1.2007年12月第一次专家统稿会（修订情况：1.在结构上增加原料功能术语、相关国际组织和科研机构等内容；2.在内容上增加一般术语、产品术语的种类，将化妆品行业的新产品类别纳入本标准；3.对于毒理学、卫生化学、微生物学术语进行修改；4.删除与化妆品联系不紧密、无存在必要的常用英文成分术语。2.2009年1月第二次专家统稿会会议意见：1.修改能引用国家标准的尽量引用国家标准；对存在歧义的个别用词进行修改。2.删除由于本标准中的“产品术语”一章和香化协会所制定的某个标准存在重复，因此删除“产品术语”一章的内容；对“原料功能术语”的内容进行梳理，删除了20余条内容。3.增加专家建议增加“化妆品限用物质”等若干项术语。第四阶段：征求意见2009年2月面向全国公开征求意见。第五阶段：征求意见的处理与形成送审稿。在征求意见的处理阶段再次征求了相关专家的意见。六、标准的内容依据1.《化妆品卫生监督条例》、《化妆品卫生监督条例实施细则》;2.《化妆品卫生规范》;3.美国21CFR；4.相关领域国家标准如：GB5296.3-2008消费品使用说明化妆品通用标签，GB/T14666-2003分析化学术语等；5.国内外化妆品的相关文献，如《化妆品监督管理及安全性评价》等。七、标准的结构和主要内容（一）结构：1.范围2.一般术语3.毒理学试验方法术语4.卫生化学检验方法术语5.微生物检验方法术语6.人体安全性和功效性评价术语7.常用原料术语8.缩写9.中英文索引（二）主要内容：1).一般术语39条涉及化妆品的基本定义、化妆品生产和监督管理中出现频率较高的术语。2).毒理学试验方法术语40条收录了《化妆品卫生规范》中涉及的术语，以及在毒理学领域出现频率较高、与化妆品毒理学试验方法联系较密切的术语。3).卫生化学检验方法术语22条收录了化妆品的卫生化学检验方法中较常用的术语。

4).微生物检验方法术语6条收录了《化妆品卫生规范》中所涉及的术语。5).人体安全性和功效性评价术语38条收录了人体安全性和功效性评价的常用术语。6).常用原料术语55条收录了常用原料术语，与《化妆品管理及安全性和功效性评价》保持一致，并根据企业、专家的意见进行了适当修改。7).缩写涉及国际机构缩写以及化妆品毒理学、化学、人体安全性和功效评价等领域专业术语的缩写34条。七、征求意见处理情况2009年2月20日，《化妆品术语》在全国公开范围内公开征求意见，截止到2009年3月末共收到来自企业、和社会各界的意见和建议共146条，分布情况如下：征求意见来源统计图二一般术语三毒理学四化