原生质体制备和转化

原生质体制备和转化第一页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo培养基成分高渗溶液（有机/无机）缓冲液的pH（5.8-7.4）酶解条件（时间/各种酶的比例）酶液用高盐还是高渗缓冲液配擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体双层or单层培养基第二页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo《微生物学实验教程》周德庆（酵母）1、接种于液体培养基上培养。2、取培养液10ml，4000r/min离心5min,弃上清液，用Tris-HCl(pH7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉淀原生质体。6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高渗缓冲液悬浮原生质体。高渗缓冲液：蔗糖0.5mol/L,MgCl210mmol/L,Tris-HCl(pH7.4)10mmol/L第三页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo1、原生质体混合、PEG助融2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合，导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养第四页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo《工业微生物育种学》施巧琴吴松刚*菌丝培养基：1、葡萄糖蛋白胨培养基2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数）3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物）*再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L第五页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo*缓冲液：pH5.8-6.8磷酸氢二钠-柠檬酸溶液*高渗溶液：0.6mol/LNaCl溶液*酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽滤除菌第六页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo取107个/mL的单孢子悬浮液，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样观察。（该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对菌丝的伤害和杂菌污染）酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次，用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液1500-2000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。双层平板，再生，计算原生质体再生率。第七页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo林艳学姐：挑AspergillusoryzaeP5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子成黄绿色取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中，置摇床上150r/min振荡分散30min经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体第八页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放情况待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶解的菌丝体残片，收集原生质体液4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀去上清，沉淀用1mol/L山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min弃上清将原生质体悬浮于5mL1mol/L山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用第九页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min；弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为5×106~5×107个细胞/mL；将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；加入25µLPTC溶液，冰浴20min；加入1mLPTC溶液，室温放置15min；最后加入2mLSTC溶液，混匀。将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~7天，所长出的菌落即为转化成功的菌株；同时设置未加质粒而转化的原生质体涂布平板作为阴性对照。第十页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo菌丝培养基葡萄糖含量为0.5%的葡萄糖-蛋白胨完全培养基。高渗再生培养基以1.2mol/LSorbitol（山梨糖醇）配制的葡萄糖-蛋白胨基本固体培养基。0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2mol/LNaH2PO4·2H2O（约240mL）和0.2mol/LNa2HPO4·12H2O（约60mL）混合至pH为6.0第十一页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo混合酶液：2%纤维素酶，1%蜗牛酶，5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）用pH6.0的含0.4mol/LNH4Cl的0.2mol/L磷酸缓冲液配置混合酶液，经0.45μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃PTC溶液：25%PEG8000，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)STC溶液：1.2mol/LSorbitol，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris-HCl(pH7.5)第十二页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo1.米曲霉C-2在2%G-P斜面培养6天至长出孢子，灭菌去离子水洗下孢子，经四层擦镜纸过滤制成孢子悬液，接种于50mL0.5%G-P菌丝全培养基，30℃静置培养23~25h；2.过滤收集菌体，用无菌水与0.8MNaCl各洗涤一次；3.菌体置于灭菌培养皿中，加入15ml酶解液（2%纤维素酶、1%蜗牛酶、3mMDTT）；4.置30℃摇床（80r/min）酶解3h左右，在显微镜下观察原生质体的释放情况；5.酶解完全后，四层擦镜纸过滤，除去未酶解菌丝，离心收集原生质体；6.用0.8MNaCl洗涤二次，0.8MNaCl-50mMCaCl2

洗涤一次；7.弃上清原生质体重悬于100μL0.8MNaCl-50mMCaCl2中，血球板计数。王金良学长：第十三页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo1、将构建的pMD-pyrG质粒与100μL原生质体置冰上轻轻混匀；加入25μL预冷PTC，冰浴30min；2、再加入500μL上述PTC溶液，平静混匀，室温20min；加入预冷1mL0.8MNaCl-50mMCaCl2，混匀；3、与100mL米曲霉高渗再生培养基混合，倒平板；30℃培养4-7天。第十四页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo培养基成分高渗溶液（有机/无机）缓冲液的pH（5.8-7.4）酶解条件（时间/各种酶的比例）酶液用高盐还是高渗缓冲液配擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体双层or单层培养基第十五页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo取培养20h的康氏木霉菌丝体悬液10mL，4000r/min离心30min收集菌丝体，用无菌水4000r/min离心30min洗涤2次，加2.0%蜗牛酶溶液30℃水浴酶解至原生质体形成率接近100%时停止酶解，用0.6mol/LNaCl5min条件下离心洗涤2次，最后将原生质体悬于0.6mol/LNaCl溶液中。在原生质体制备过程中每隔一定时间取酶解液制成水封片于显微镜下观察。第十六页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo取原生质体悬液1mL与5mL上层再生培养基混匀，倾倒于下层再生培养基平板上，待培养基凝固后于28℃培养箱中倒置培养。用下式计算再生率：再生率（%）=（A-B）/C×100%式中：A为经高渗溶液稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数；B为经无菌水稀释的原生质体在再生培养基上长出的菌落数；C为显微镜下计数的原生质体数。第十七页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo培养时间22h酶种类和浓度单一蜗牛酶，3%酶解时间2.5h酶解温度36℃渗透压稳定剂无机盐溶液有利于原生质体的释放，而糖醇类不利于原生质体释放（NaCl）原生质体制备第十八页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo原生质体再生酶种类和浓度单一蜗牛酶，2%酶解温度30℃渗透压稳定剂糖﹑醇类有利于原生质体的再生而无机盐类物质不利于再生（蔗糖）再生培养基中蔗糖浓度0.8mol/L康氏木霉原生质体制备的最适菌龄为22h，蜗牛酶浓度为2.0%，酶解温度为30℃，酶解时间为2.5h，蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为0.6mol/LNaCl，再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8mol/L蔗糖第十九页，共二十一页，编辑于2023年，星期二CompanyLogo菌丝体培养60h,用1.5%溶菌酶+0.5%蜗牛酶混合酶液,pH值6.0～