实验十 水中大肠菌群的含量测定

实验十水中大肠菌群的含量测定第一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二一、目的要求

1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。2．了解大肠菌群的检测作为饮水卫生指标的重要性。第二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二二、基本原理

多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。1．初（步）发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。第三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。第四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二2．平板分离平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇smedium）或伊红美蓝琼脂（eosinmethyleneblueagar，EMBagar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。第五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二

伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。3．复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。第六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二三、器材

1、培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水；2、仪器或其他用具载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。第七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二四、操作步骤1．水样的采取

1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

2）池水、河水或湖水应取距水面10～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。第八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二2．自来水检查（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18～24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。第九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二

（a）深紫黑色、有金属光泽。（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。（c）淡紫红色、中心颜色较深。（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。第十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二3．池水、河水或湖水等的检查（1）将水样稀释成10-1与10-2。（2）分别吸取1ml10-2、10-1的稀释水样和1ml原水样，各装入有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。

第十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二

（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。（4）将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数。第十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第十四页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第十五页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第十六页，共二十五页，编辑于2023年，星期二初发酵前第十七页，共二十五页，编辑于2023年，星期二初发酵后阳性管---产酸、产气结果第十八页，共二十五页，编辑于2023年，星期二EMB平板分离典型结果1---绿色金属光泽菌落第十九页，共二十五页，编辑于2023年，星期二EMB平板分离典型结果2---黑紫色不带或略带金属光泽菌落第二十页，共二十五页，编辑于2023年，星期二EMB平板分离典型结果3---淡紫红色中心颜色较深菌落第二十一页，共二十五页，编辑于2023年，星期二复发酵实验结果----产酸、产气第二十二页，共二十五页，编辑于2023年，星期二五、实验报告

（1）自来水

100ml水样的阳性管数是多少？

10ml水样的阳性管数是多少？查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？（2）池水、河水或湖水阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？第二十三页，共二十五页，编辑于2023年，星期二第二十四页，共二十五页，编辑