凝血分析的质量控制

凝血分析的质量控制整理ppt第一页，共四十七页。一、概述:从1949年美国CollegeofAmericanPathologists〔简称CAP〕首先开始研究临床实验室室内质量控制〔简称质控〕问题，美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉开序幕。

到70年代，实验室质量控制进入一个新的阶段—全面质量管理，推行GoodLaboratoryParctice〔简称GLP〕。进入80年代末期，GLP的统一标准产生了，开展到〞认证实验室〞管理阶段。

全面质量管理的宗旨在于预防过失的产生。质控图的统计学质控的目的是检出过失。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。整理ppt第二页，共四十七页。1.根本概念۩质量控制〔QuailityControl,Q.C〕

质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一个反响环路进行的。

1〕确定控制的对象；

2〕规定控制对象的标准〔预期值〕；

3〕制定或选择控制方法和手段；

4〕测量实际数据；

5〕比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反响通道中断。整理ppt第三页，共四十七页。

6〕采取行动，解决差异。恢复原状〔原标准状态〕的手段发挥作用。

质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的“控制限〞进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的“可追查〞性原因。“可追逆〞性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。“控制限〞是通过统计计算出来的，详细介绍见室内质控程序。整理ppt第四页，共四十七页。۩标准品

国际标准品由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定值材料。

国际生物学活性标准品根据生物学反响由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材料。

参考标准血清国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。组织凝血活酶标准化应用的国际参考品〔internationalreferencepreparationIRP〕，有以下几种：

整理ppt第五页，共四十七页。〔1〕单一组织凝血活酶国际参考品：是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂。WHO在英国使用的统一标准的“英国比较凝血活酶〞〔Britishcomparativethromboplastin,BCT〕为根底，制备WHO的原级凝血活酶参考品〔primaryreferencepreparation〕，如人脑组织凝血活酶，编号67/40。同时又以BCT67/40为根底标化了次级参考品〔secondaryreferencepreparation〕。如牛脑组织凝血活酶，编号为68/434；兔脑为70/178。后来WHO还公布了一些次级组织凝血活酶参考品，如人脑或胎盘制剂，如BCT/253；兔或兔、猴组织混合制剂，如RBT/79等。

整理ppt第六页，共四十七页。〔2〕复合组织凝血活酶国际参考品：它是组织提取物的生理盐水悬液中参加适量的纤维蛋白原、因子V和氯化钙组成的制剂，如牛组织凝血活酶OBT/79等。

目前世界各国都广泛应用WHO的这些参考品来校正本国或本地区制备或生产的组织凝血活酶参考物。这样使世界范围内有了多种组织凝血活酶参考品。〔3〕组织凝血活酶工作制剂〔workingpreparation,WP〕的国际敏感度指数〔internationalsensitivityindex,ISI〕：由于不同组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同。为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。这就需要通过自制的试剂与国际参考品〔IRP〕进行比较，然后得出一个校正值。具体的方法如下：

整理ppt第七页，共四十七页。①用国际参考品〔IRP〕标定国家、地区或本实验室的参考制剂〔referencepreparation,RP〕。②用实验室参考制剂〔RP〕标定工作制剂〔WP〕。

1〕标本：2份正常人血浆和6份口服抗凝剂达6周的患者血浆，连收10天，共60份标本。

2〕测定：按一定顺序进行测定，每份标本重复测定2次。将PT测定的结果〔秒〕点在双对数坐标纸上，横坐标代表WP的PT测定结果，纵坐标代表RP的PT测定结果，画出最佳答案的各点拟合直线，得出定标曲线，通过WP/RP比值，或回归方程求出斜率b。

3〕计算WP的ISI值：

ISI值愈接近于1.0，说明组织凝血活酶试剂愈敏感，因此，生产和出售组织凝血活酶试剂的厂商，必须在产品上标有ISI。整理ppt第八页，共四十七页。二、凝血检验的质量控制(一)标本采集的质量控制:血标本的采取应注意的问题

1．PT、APTT凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，“一针见血〞，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管。

2．凝血实验标本最好不与其他实验一起采集，否那么由于标本的分配、分装等而使血液停留在针管的时间延长，和一般血液采集，进入容器及进行实验所用时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取血的做法不可取。

整理ppt第九页，共四十七页。3．取血时病人应松驰，环境温暖，防止静脉孪缩，止血带的压力要尽可能小，压力大及束缚时间长可影响局部血液的浓缩和内皮细胞释放t-PA,后者将引起纤溶活性增强，血小板释放应及某些凝血因子活性增加。取血注射器的针头长短和内径应标准化，国际上推荐用21G1.5或20G1.5针头。取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平衡地进入注射器，防止气泡的产生。整理ppt第十页，共四十七页。

4．一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合。一般提倡使用真空采血管。此管有充分的透明度，根据取血量设计，有2.0ml、5.0ml、10ml各种血液收集管，真空负压并定量的抗凝剂，能保证抗凝剂与取血量的比例，且能有充分的空间便于血液和抗凝剂混合。5．应该用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑到结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%以内。

整理ppt第十一页，共四十七页。6．采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。笔者曾对不同条件保存的血浆因子变化进行了探讨，结果显示在32℃保存血浆6小时、12小时、24小时Ⅷ因子活性可分别消失50%、60%和95%，即使保存在4℃内也分别消失5%、55%、70%。V因子活性在32℃分别消失25%、40%和80%，而在4℃那么仅损失0%、5%、10%。因此测定APTT的血浆在-80℃至少可保存1个月、4℃为6小时、20℃为6小时、而32℃仅为2小时，做PT血浆，在4℃为24小时，20℃为6小时、32℃为4小时。

整理ppt第十二页，共四十七页。7．ICSH、ICTH推荐使用3.2g/dl(含2112O)或0.109mmol/l的枸橼酸钠作为凝血因子检查的抗凝剂。另外，近年来，许多试验室采用缓冲抗凝剂，这种试剂对标本经冷冻保存后再行分析更为适宜。因为无缓冲剂，血浆pH值随时间而增加，凝固时间可延长，特别是Ⅷ因子即使是在-20℃保存，其凝血活性也可减少50%。缓冲剂的作用是维持血浆恒定pH，防止易变因子失活。血液与抗凝剂的比例必须相当精确，抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，一定要注意采血时血液与抗凝剂的比例。应指出，所谓血液与抗凝剂按9：1比例混合，实际上是指抗凝剂与正常压积血液的血浆之间的比例而言。因此应根据患者红细胞比例〔Hct〕状况随时高速抗凝剂用量。整理ppt第十三页，共四十七页。(二)仪器及试剂的选择的质量控制

1．购置仪器后应按说明书标出的仪器应能到达的性能参数对仪器进行评价，发现问题及时与厂家联系。2．在检测过程中使用的加样器应进行校准，保证试剂稀释和加样量的准确。3．有定标血浆的检测工程，须用定标血浆建立标准曲线，在更换试剂批号或种类时均应用定标血浆重新建立标准曲线。

整理ppt第十四页，共四十七页。4．试剂在预温槽内的放置时间应严格按试剂说明书的要求进行限定，放置时间延长会影响测定结果的准确性。5．鉴于目前凝血试验标准化工作还有待完善，不同检测系统〔仪器、试剂、定标血浆、质控物〕测出同一标本的结果有差异，为此在更换试剂种类甚至批号时有必要重新建立正常参考范围。6．最好是用与仪器厂家相同的品牌试剂。整理ppt第十五页，共四十七页。(三)凝血分析室内质量控制方式的选择及程序设计1.质控方式及设计过程质控方式：适合于血凝的质控有1〉Levy-Jeninings质控图2〉“即刻性〞质控3〉Westgard多规那么质控图为了获得优化的性能,质控方法必须具有尽可能低的假失控概率(Ｐｆｒ)和尽可能高的误差检出概率(Ｐｅｄ)。假失控概率和误差检出概率将依赖于质控规那么和在分析批上质控测定值的个数(Ｎ)。整理ppt第十六页，共四十七页。1〉Levy-Jeninings质控图设计过程：通过以下步骤来确定质控范围。

①最佳答案条件下的测定误差。最佳答案条件下能看出值质控血清变异

〔optimalconditionsvariance,简称OCV〕的测定在本实验室

最佳答案条件下〔包括操作者、试剂、仪器等〕检测质控血清20-30次，测

得结果计算，求出该组数据的均值和标准差〔SD〕表示该实验室的最

佳工作质量。

②能看出值的血清在常规检验条件下的误差。常规条件下能看出

值质控血清变异〔routineconditionsvariance-knownvalue,简称

RCVK〕的测定。

整理ppt第十七页，共四十七页。做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。假设太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后〔例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等〕，重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是最佳答案条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。整理ppt第十八页，共四十七页。③未知值的血清在常规检验条件下的误差。常规条件下,未知值质控血清变异(routineconditionsvariancl-unknownvalue简称RCVU)的测定，有时为了防止主观性,再作RCVU测定。测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。④临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统觉察不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。整理ppt第十九页，共四十七页。⑤质控图

通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。质控血清的值低于-2SD的范围,属〞告警〞，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。

血凝试验中，各种检验工程的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为〞告警〞，二次超出2SD为〞失控〞。当质控过程中，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原因,此时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。整理ppt第二十页，共四十七页。一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。

第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易觉察的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。整理ppt第二十一页，共四十七页。省医院质控规那么⑴警告：质控工程检测值超出±2S。⑵失控：质控工程检测值超出±3S，连续两次测定结果差值超出4S；同一天两水平质控同时超过2S。整理ppt第二十二页，共四十七页。2〉统计学计算方法—“即刻性〞质控法

以上介绍的质控方法根本上与临床化学测定的质控方法相同，“即刻法〞的建立具体计算方法如下：

1)先将测定值从小到大排列

2)计算X和SD。

3)计算SDI上限和SDI下限值。

整理ppt第二十三页，共四十七页。4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限有一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于〞告警〞状态；当SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属〞失控〞。数值处于〞告警〞和〞失控〞状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。整理ppt第二十四页，共四十七页。即刻性质控统计方法，适于凝血测定的质控。当检测的数值超过20次以后，不必再使用〞即刻法〞质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即可。整理ppt第二十五页，共四十七页。3〉Westgard多规那么质控图及设计过程①以“允许总误差〞(ＴＥａ)形式规定每一试验的临床质量要求,如采用美国临床实验室改进修正案(ＣＬＩＡ88)能力验证方案的评价限。②从3个月的质控物检测的值计算每一试验的稳定标准差(ｓ)或变异系数(ＣＶ);方法的不准确度(ｂｉａｓ)是根据参加卫生部临床检验中心室间质评方案确定(测定结果与靶值之间的偏差)。整理ppt第二十六页，共四十七页。③计算临界系统误差(△ＳＥｃ)和临界随机误差(△ＲＥｃ):△ＳＥｃ=(ＴＥａ-|ｂｉａｓ|)/ｓ-1.65△ＲＥｃ=(ＴＥａ-|ｂｉａｓ|)/1.65ｓ(ｂｉａｓ≠0)④由计算机模拟程序确定候选质控方法的性能特征。通过图形插入法可估计假失控概率和误差检出概率。⑤设定质控方法检出系统误差概率90%为目标,同时维持尽可能低的假失控。随机误差高检出率是其次考虑的目标。整理ppt第二十七页，共四十七页。⑥采用质控计算机模拟程序(ＱＣＣＳ)该程序由王治国开发,菜单提供多种质控规那么,其中包括12ｓ,12.5ｓ,13ｓ,13ｓ/22ｓ/Ｒ4ｓ和Ｗｅｓｔｇａｒｄ多规那么(13ｓ/22ｓ/Ｒ4ｓ/41ｓ/10ｘ)。以1000模拟批获得失控概率的估计值。根据以上步骤，以ＡＣＬ200凝血试验分析仪为例予以说明医学上重要的误差表1概括了在设计过程前三步所需要的资料,即ＴＥａ、分析的ＣＶ(%)、ｂｉａｓ、△ＳＥｃ、△ＲＥｃ。整理ppt第二十八页，共四十七页。整理ppt第二十九页，共四十七页。整理ppt第三十页，共四十七页。整理ppt第三十一页，共四十七页。图1,2分别显示的是几种质控规那么检出系统误差的性能特征,其中Ｎ分别为2,4。利用模拟研究获得的成效函数图,即是失控概率与分析误差大小的关系图。对ＡＰＴＴ,用12.5ｓ控制规那么(Ｎ=2)就能容易地到达90%以上的误差检出目标。对于ＰＴ和纤维蛋白原,使用Ｗｅｓｔｇａｒｄ多规那么(13ｓ/22ｓ/Ｒ4ｓ/41ｓ/10ｘ)(Ｎ=4)可到达90%的误差检出。整理ppt第三十二页，共四十七页。图112ｓ,12.5ｓ,13ｓ和Ｗｅｓｔｇａｒｄ多规那么(13ｓ/22ｓ/Ｒ4ｓ/41ｓ/10ｘ)检出系统误差的成效函数图(Ｎ=2)图212ｓ,12.5ｓ,13ｓ和Ｗｅｓｔｇａｒｄ多规那么(13ｓ/22ｓ/Ｒ4ｓ/41ｓ/10ｘ)检出系统误差的成效函数图(Ｎ=4)23对ＡＣＬ200凝血试验分析仪推荐的质控方法见表2。整理ppt第三十三页，共四十七页。整理ppt第三十四页，共四十七页。对于凝血分析仪可能有不同的策略对其进行控制:(1)不同的试验每批质控测定值个数(Ｎ)相同,但质控规那么不同;(2)不同的试验选择特定的质控规那么,但Ｎ不同;(3)不同的试验可选择不同的Ｎ和质控规那么。很明显,仔细的质控设计是必需的,要考虑测定方法的性能(不精密度和不准确度),还要考虑质控方法本身的性能特征(误差检出概率和假失控概率)。整理ppt第三十五页，共四十七页。在使用这种设计步骤上,一旦知道临界系统和随机误差的大小,选择质控方法的任务就变得很清楚。大的临界误差建议具有较少Ｎ和宽的质控限的质控方法是恰当的。小的242临界误差说明需要较多的质控测定值和较窄的质控限及可能多个规那么的质控方法。重要的是要认识到临界误差的大小依赖于测定系统的分析性能,△ＳＥｃ和△ＲＥｃ是临床质量要求与测定方法标准差比值的函数。整理ppt第三十六页，共四十七页。对于给定的临床质量要求,当测定方法不精密时,将导致小的临界误差;当测定方法非常精密时,将导致大的临界误差。不同的质控方法适合于具有不同精密度的仪器系统;高的精密度一般允许较简单和更具有本钱-效率比的质控设计。当精密度到达较高水平时,△ＳＥｃ值将是4.0或更大。这样大的误差相对地将容易被检出,如图1,2所示。整理ppt第三十七页，共四十七页。这些特定的质控方法应用于其他的实验室,依赖于是否存在类似的临床质量要求及是否可到达类似的分析性能(即不精密度和不准确度)。但是一般的设计质控方法的步骤是适合于所有的实验室,所有的仪器系统,及所有的分析工程,由此可选择出适合于特定实验室每项试验的质控规那么和质控测定值个数。整理ppt第三十八页，共四十七页。2.结果判断及报告根据当日质控及质控图判断分析结果是否在控，对于失控，要查找原因，排除干扰因数后复查。检查结果以标准化方式报告，如：PT测定结果的报告方式：理论上，无论何种组织凝血活酶，只要标有ISI，就可与国际参考制品进行比照校正，并可用同一种计量单位报告。1985年ICSH和ICTH推荐以PT监测口服抗凝剂的报告方式是国际正常化比率〔internationalnormalizderatio,INR〕。INR的计算公式如下：整理ppt第三十九页，共四十七页。在用INR后，各种敏感性不同的组织凝血活酶均可得到相同的INR值。

仪器特有有ISI：上述PT根据报告方式适用于手工法〔试管倾斜法〕测定PT。但是手工法与仪器法以及仪器法与仪器法测定PT的INR之间，仍有差异。研究说明，在ACL、CobasFibro和Coaga-Pet三台自动化仪器上，使用同一种ISI为1.12的ThromborelS试剂，测定PT的均值分别为10.7秒、12.1秒和11.1秒。但假设以同一ISI值计算INR，得出的数值也存在着不同程度的差异。整理ppt第四十页，共四十七页。为此，专家们提出建议：同一组织凝血活酶试剂用于不同仪器时，可用所谓的“仪器特有的ISI〞〔instrumentspecificISIs〕或称区域性ISI〔LocalISI〕来计算INR。每台仪器所使用的凝血活酶试剂都应该有特定的ISI值，重新标定ISI值的做法是购置标有INR的冻干血浆，然后在自己的仪器上再标定所使用凝血活酶试剂的ISI值，这样才可使病人的INR具有可比性。整理ppt第四十一页，共四十七页。综上所述，质量控制是保证实验结果准确的重要措施，由于凝血因子检测可受多种因素干扰