显微镜的概述

显微镜的概述第一页，共五十三页，编辑于2023年，星期三11、光学显微镜有哪些光学参数？如何正确应用这些参数？2、什么叫数值孔径、放大率和分辨率？他们由哪些因素决定以及他们之间有何关系？3、透镜有几种像差？怎样产生的?如何消除？4、物镜与目镜在工作条件和技术要求上有些什么不同？如何正确使用？5、物镜上标有“10/0.25”，“160/0.17”，请说明这些数字所表示的意义？第二页，共五十三页，编辑于2023年，星期三26、可变光栏的作用是什么？7、显微镜的聚光镜与物镜的怎样进行搭配？8、显微镜照明系统的基本要求是什么？

9、显微镜的照明方式分为几种？各有何特点？10、显微镜的光学系统有哪几部分组成？各起什么作用？第三页，共五十三页，编辑于2023年，星期三3光学显微镜(opticalmicroscope)简称光镜或显微镜，是一种将肉眼无法直接看清楚的微小物体进行光学放大成像的常用仪器。第一节光学显微镜概述第四页，共五十三页，编辑于2023年，星期三4一、光学显微镜的发展简史

第五页，共五十三页，编辑于2023年，星期三5

荷兰的眼镜商詹森（ZacchariasJanssen）Janssen和他的显微镜——世界上最早的一台显微镜显微镜的发展历史

——16世纪6第六页，共五十三页，编辑于2023年，星期三6MarcelloMalpighi通过显微镜为血液循环理论提供了证据

RobertHook改进了显微镜，并发现了细胞

显微镜的发展历史

——17世纪RobertHooke和他的显微镜7第七页，共五十三页，编辑于2023年，星期三7Hooke观察到的软木片的细胞结构Hooke显微镜下的跳蚤8第八页，共五十三页，编辑于2023年，星期三8荷兰人安东尼·冯·列文虎克（AnthonyVonLeeuwenhoek)列文虎克的显微镜显微镜的发展历史

——17世纪9第九页，共五十三页，编辑于2023年，星期三9现代的光学显微镜显微镜的发展历史

——18~19世纪10第十页，共五十三页，编辑于2023年，星期三10根据不同的使用用途，光学显微镜可分为:

普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜倒置显微镜体视显微镜偏光显微镜等10多种。

第十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期三11普通的光学显微镜是由两组透镜所组成，左边小的透镜代表一组焦距很短的透镜组，称为物镜；右边一组焦距较长的透镜组称为目镜。其成像原理如图所示。二、显微镜的光学原理第十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期三12显微镜的成像原理图经物镜、目镜放大后得到放大的倒立的虚像。第十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期三13Inthecompoundmicroscope,theobjectiveformsareal,invertedimageattheeyepiecefrontfocalplane(theprimaryimageplane)第十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期三14二、显微镜的光学原理１）将被观察的物体AB置于物镜前的物方焦点F1稍外的地方，物体AB发出的光线经物镜O1放大后成一倒立实像A’B’于目镜前焦点附近；第十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期三15２）再经目镜O2放大后，我们就可以获得一个经两次放大的倒立虚像A''B''，该虚像呈现在观察者的明视距离处。第十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期三16三、显微镜的性能参数

（一）数值孔径

（二）分辨率（三）放大率（四）视野（视场）（五）景深（焦点深度）（六）工作距离（七）镜象亮度（八）清晰度第十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期三17（一）数值孔径数值孔径(numericalaperture)的概念：又叫做镜口率，简写为N.A.。表示物镜吸光本领的大小，常用物体与物镜间介质的折射率n与物镜镜口角的一半(α/2)的正弦值的乘积来表示(如图所示)；数值孔径的数学表达式：

N.A.=n·sinα/2第十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期三18镜口角的概念：被观察点射入物镜边缘光线间的夹角是一个圆锥角叫镜口角。α/2物镜的镜口角镜片第十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期三19镜口角α的大小能说明什么？镜口角的大小能说明进入物镜光量的多少。镜口角越大进入的光量越多，此物镜的聚光本领越强，物像的量度越大，物像就更清楚、明显。第二十页，共五十三页，编辑于2023年，星期三20数值孔径的意义：数值孔径是衡量显微镜性能的极为重要的一个技术参数，它决定或影响着显微镜的其它性能参数。

1）它与放大率成正比，与景深成反比；

2）它的平方与图像亮度成正比；

3）数值孔径越大，其视场和工作距离则越小。

第二十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期三21提高数值孔径的方法：

N.A.=n·sinα/2一、增大镜口角α；二、增大物镜与标本之间介质的折射率n。

第二十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期三22数值孔径增大的程度：采取增大镜口角α方法时，可以让标本与物镜尽量靠近；采取增大折射率n方法时，第二十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期三23例如：设α=111012`,当物镜与标本之间以空气为介质时，数值孔径:

N.A.=n·sinα/2=1×sin111012`/2≈0.83

第二十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期三24当物镜与标本之间以香柏油为介质时，数值孔径:

N.A.=n·sinα/2=1.515×sin111012`/2≈1.25

可见，在α相同的情况下，加入香柏油以后，可使数值孔径由0.83提高到1.25。目前，在实用范围内，油镜所能达到的最大数值孔径为1.4。第二十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期三25（二）分辨率分辨率的概念：又称鉴别率或分辨本领，是指显微镜分辨被检物体的微细结构的能力。分辨距离的概念：是指能被分辨开的两物点间的最小距离。第二十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期三26衍射斑的概念：根据光的衍射理论，点光源放出的光波经透镜会聚后并不是一个理想的清晰的亮点，而是一个中央亮、外面依次是暗明相间的环，称作衍射斑。平行光束单缝衍射双缝衍射光波的衍射（Diffraction）

衍射：当一束平行光通过窄的开口如狭缝时发生弯曲的现象。

第二十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期三27瑞利条件（根据光的衍射理论）：

两个相邻的点光源能够经光学折射系统被分辨开来的必要条件是每一个衍射斑的中央亮圆中心落在另一个衍射斑的第一暗环上。瑞利以此作为光学系统的分辨极限，称为瑞利条件。平行光束单缝衍射双缝衍射光波的衍射（Diffraction）

衍射：当一束平行光通过窄的开口如狭缝时发生弯曲的现象。

第二十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期三28AiryDiskFormationbyFiniteObjectiveApertureThewidthofcentralmaximumprop.toandinverslyprop.toobjectiveaperature第二十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期三2930光学显微镜的分辨本领第三十页，共五十三页，编辑于2023年，星期三30分辨率与分辨距离的关系：它与“分辨距离”成反比。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。如果两物点间的距离小于分辨距离，就会把两点看成一点，也就不能看清它的结构。显微镜的分辨率是由物镜来决定的。目镜只起“放大镜”的作用，并不提高显微镜的分辨率。第三十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期三31物镜的分辨距离的数学表达式：在普通中心照明的情况下，物镜的分辨距离由下式决定：

d=λ/2N.A.

式中d表示分辨距离，入表示照明光线的波长。第三十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期三32

用可见光照明的普通显微镜，分

辨距离的极限是多少？在可见光中亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0.55um；物镜最大的N.A.为1.4；代入公式：d=λ/2N.A.可得：d＝0.55／(2X1.4)≈0.2um。即利用可见光的普通显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的极限为0.2um。第三十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期三33提高物镜的分辨率的方法：分辨距离公式：

d=λ/2N.A.1）、提高物镜的数值孔径N.A.。2）、使用波长较短的照明光线。第三十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期三34

利用紫外线作为光源的分辨距离与可见光的比较：紫外线的波长比可见光短，约为0.27um，可见光波长为0.55um；利用紫外线作为光源的紫外显微镜，分辨距离公式：

d=λ/2N.A进行计算；其分辨率高于可见光一倍，分辨距离可达0.1um。但因为眼睛看不见紫外线，只有拍成照片以后再观察。比紫外线的波长更短的还有x射线，γ射线等，但目前没有发现可用的透镜材料。第三十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期三35第三十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期三36（三）放大率显微镜的放大率的概念：指物体经物镜、目镜两次成像后眼睛所能看到像的大小与原物体大小的比值。即是物镜的单向放大率m和目镜的角放大率α的乘积。第三十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期三37显微镜的放大率数学表达式：

M=m·α=L/f物×250/f目

式中M表示显微镜的总放大率；

L/f物表示物镜的放大率；

250/f目表示目镜的放大率；

L表示显微镜的光学筒长；

f物表示物镜的焦距；

f目表示目镜的焦距；

250(毫米)表示明视距离。第三十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期三38为什么显微镜的放大率不能无限的增大？

1）M=m·α=L/f物×250/f目

从公式可知，物镜和目镜的焦距愈短，光学筒长愈长，总放大率愈大。但焦距太短或镜筒过长，都会造成工作不方便。因此，显微镜的放大率不能无限的增大。

2）显微镜的放大率是受分辨率制约的。如果标本的细节不能分开来，过度的放大，毫无意义。

第三十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期三39显微镜将标本的细节分辨清的条件：

要看清标本的细节，必须同时满足两个条件：

1）物镜有足够的分辨率，以保证像不互相重叠；（d=λ/2N.A.)2）显微镜有足够的放大率，以保证像在眼中所张的视角大于1分(小于1分时眼睛看不见)。这两个条件缺一不可，否则就看不清或看不见像的细节。

第四十页，共五十三页，编辑于2023年，星期三40显微镜最合适的总放大率：

显微镜最合适的总放大率(称为有效放大率，用M有效表示)是在物镜数值孔径的500～1000倍之间。即500N.A.≤M有效≤1000N.A.

在有效放大率范围内，眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果总放大率低于500N.A.，观察起来很吃力。反之，如果高于1000N.A.，则会使像质变坏，甚至造成不真实的像。

第四十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期三41标本的细节首先必须由物镜分辨开来，然后再把它放大到适合眼睛观察的程度就可以了。实验证明：对眼睛来说视角放大到2分~4分之间最合适。眼睛可以长时间观察而不易疲劳。视角是指眼睛里水晶体中心至被观察的物象两端点的连线之间的夹角，如图所示。视角ABAB放大后的物象第四十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期三42现将视角θ为2分（=0.00058弧度）时的情况如下：设显微镜的总放大率M，则放大后两细节间的距离为Md，而且成象在明视距离250mm处，如图所示。250mmΘ=2分Mdθ假定两细节间的距离为d，把视角放大到2分与4分之间时,显微镜的最合适的总有效放大率为多少？第四十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期三43

则有：tanθ≈θ=Md/250(因θ很小时，tanθ≈θ）或：0.00058=Md/250

将公式d=λ/2N.A.代入上式，并取

λ=0.55um=0.55x10-3mm，整理后可得：

M=527N.A.≈500N.A.

用同样的方法可以计算：当视角为4分时

M≈1000N.A.θMd250mm第四十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期三44（四）视野（视场）视野的概念：又称视场(field)，是指显微镜一次所能看到被检标本的范围。视野宽度：由于它由目镜的视场光阑局限成圆形，则把该圆形视野的直径称为视野宽度d。第四十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期三45视野宽度与视野的关系：d取决于物镜的放大倍数及目镜的光阑大小，小放大倍数和大光阑可获得较大的视野。当视野中不能容放整个标本时，要通过机械装置移动标本进行分区或连续移动观察。

第四十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期三46视野（视场）与放大率的关系：

视野的大小与显微镜的总放大率成反比，总放大率愈大，视野越小。第四十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期三47(五)景深（焦点深度）(depthoffield)景深又称焦点深度(focaldepth)，是指当显微镜调焦于某一物平面(对准平面)时，位于对准平面前后二侧的二个仍能清楚观察的平面间的距离。（不仅这一物平面可以看清楚，而且和它相连的上下物平面也同时看清楚，这上下两物平面之间的距离叫做焦点深度。）第四十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期三48显微镜的数值孔径愈大，景深