【高中生物】基因工程赋予生物新的遗传特性（2）课件+高二下学期生物浙科版选择性必修3

4.1基因工程赋予生物新的遗传特性（2）

——基因工程的基本操作程序三、基因工程的一系列操作可使生物获得新的遗传特性主要需要四个步骤：获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物。培育转基因大肠杆菌生产人胰岛素一般需要哪些步骤？基因结构原核生物基因真核生物基因非编码区位置作用主要结构编码区位于基因的两端对基因的表达起调控作用启动子终止子与RNA聚合酶结合，控制转录的开始当RNA聚合酶到达时，释放出RNA产物，转录结束核苷酸序列是连续的，转录出的mRNA可直接作为翻译的模板核苷酸序列是不连续的，分为外显子和内含子，两者均会被转录成mRNA前体，再在核内切去内含子对应部分，加工成为成熟的mRNA。启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别归纳总结

启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置作用DNA片段mRNA上三个相邻碱基DNA片段mRNA上三个相邻碱基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部分，驱动基因转录出mRNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束（一）获取目的基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。1.目的基因：2.获取目的基因的方法（1）化学合成法

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成DNA合成仪①前提：基因比较小、核苷酸序列已知③方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因②过程2.获取目的基因的方法（1）化学合成法基因组文库cDNA文库（2）从基因文库中获取需已知目的基因全部序列

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。（1）建立基因组文库某生物所有DNA特定的限制酶基因组所有基因每个基因和载体结合重组DNA分子导入受体菌基因组文库（2）建立cDNA基因文库双链DNA片段（cDNA）某种生物的成熟mRNA单链DNA导入受体菌中储存cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶与载体连接2.获取目的基因的方法（1）化学合成法基因组文库cDNA文库（2）从基因文库中获取需已知目的基因全部序列

蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成（3）利用PCR技术获取和扩增利用PCR获取和扩增目的基因PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？①聚合酶链式反应（简称PCR）②PCR的条件耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）四种脱氧核苷三磷酸（dNTP））DNA模板引物稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）1.名称：脱氧腺苷5′-三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷5′-三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷5′-三磷酸(dCTP)和脱氧胸腺苷5′-三磷酸(dTTP)。DNA复制时，脱氧核苷酸链的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量，dNTP才能提供足够的能量，四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）3.作为原料的原因2.结构PCR的引物引物其实就是引子，是一小段单链DNA（体内DNA复制所用的引物是RNA），是作为DNA复制的起始点，决定PCR扩增产物的特异性和长度。1.概念2.引物的长度其长度常用的是15～30个脱氧核苷酸因为过短则特异性低。过长的引物会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物的种类PCR扩增时应有两种引物，即分别能与两条模板链配对的两种单链DNA。4.结合位点由于DNA复制只能是5'→3'进行，而DNA的两条单链又是反向平行的。5.设计引物的要求引物是复制时所要合成的新链中的一段，在整个PCR周期都一直存在（体内DNA复制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。要考虑长度、G/C碱基对的数目外，还要避免两个引物（特别是3’端）间发生互补，避免引物内部出现二级结构等。6.引物数量要求模板链的3’端（2011·江苏）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（图1），请分别说明理由。①第1组：

；②第2组：

。引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(2016·天津）采用PCR技术扩增HSA基因。图3中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因PCR过程925575℃变性3`5`5`3`第一轮含有目的基因的双链DNA片段氢键断裂，DNA解聚为单链温度上升到90℃以上变性925575℃退火Taq聚合酶引物1引物2原料第一轮两条DNA单链引物和两条单链DNA碱基互补配对温度下降到50℃左右复性925575℃延伸Taq聚合酶引物1引物2原料第一轮引物和互补DNA结合脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则合成新的DNA链温度上升到72℃左右延伸思考：循环N次，会得到多少个DNA分子呢？925575℃变性Taq聚合酶引物1引物2原料第二轮925575℃退火Taq聚合酶引物1引物2原料第二轮925575℃延伸Taq聚合酶引物1引物2原料第二轮925575℃变性第三轮925575℃退火第三轮925575℃延伸第三轮思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？③PCR反应过程④PCR产物鉴定常用方法：琼脂糖凝胶电泳原理：核酸是带有负电荷的生物大分子，在电场作用下，向正极移动，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。结果：a.每个条带包含的DNA片段长度是相同的。b.DNA可用荧光或放射性染料对DNA进行标记或用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。c.DNAMarker是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物。讨论1.目的基因双链DNA片段在第

次循环后出现。2.第n次循环后共有

个分子。这些分子可以分为3种类型：目的基因双链DNA片段为

个，双链中有1条链长于目的基因的DNA片段为

个，双链均长于目的基因的DNA片段有

个。3.共进行n轮循环，总共消耗引物A的数量

个。第n轮循环后，含有引物A的DNA数量

个。三（2n-2n）2（n-1）22n2n-12n-1利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似，如图所示。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。①从理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为

。②在第

轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。15/16三PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶引物温度结果联系解旋酶催化DNA在高温下变性解旋主要在细胞核内细胞外解旋酶、DNA聚合酶热稳定TaqDNA聚合酶细胞内温和条件3个温度，需在不同温度下进行合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成RNA、最后切除单链DNA、始终存在用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNAPCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定一、实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；热变性调节温度自动调控温度30②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；DNA半保留复制2.DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是电泳。可解离的基团带电分子与它所带电荷相反②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关④凝胶中的DNA分子使用

进行染色，再用

以及蒸馏水

，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度亚甲基蓝溶液75%酒精脱色DNA分子的大小构象二、材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）2μL20μmol/L的引物A4μL20μmol/L的引物B4μL无菌H2O32μLTaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1μL酵母细胞菌液2μL总体积50μL⑧PCR反应体系的配方⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等

预变性使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。三、方法步骤1.PCR扩增（1）移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（2）离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）（3）反应：参照右图的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。2.琼脂糖凝胶电泳（1）配制琼脂糖溶液

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。（2）制备凝胶①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入胶盒，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。（3）加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（4）电泳盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪设置成80V，开始电泳。25min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。3.染色染色方案1：（1）将凝胶放入培养皿，倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶5mm，染色8min。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。染液使用后可回收利用。（2）倒入75%酒精没过凝胶5min，不断晃动培养皿1～1.5min。再倒去酒精。（3）加入冷的蒸馏水进行脱色。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。此过程中可更换染蓝的蒸馏水。如果凝胶在蒸馏水中浸泡过久，条带颜色会变淡直至无色。染色方案2：

向盛有凝胶的培养皿倒入0.002%亚甲基蓝溶液，没过凝胶5mm。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。第二天观察到清晰的蓝色区带时，倒去染液，终止染色。染液可回收利用。4.观察注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。讨论1.本实验活动的对照组应该如何设计？2.请根据本活动中提供的引物序列，写出PCR产物两端的DNA双链序列。在配制对照组PCR体系时，用等体积的无菌水代替酵母菌细胞悬液，其他条件均相同。5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG……GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’3’-AGGCATCCACTTGGACGCC……CGTATAGTTATTCGCCTCCT-5’目的：避免外源DNA的污染1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。

如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。（二）构建重组DNA分子获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？若这样操作，效果如何？目的：确保目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且能遗传给下一代。核心步骤1.过程：结合图示，概述基因表达载体构建的流程：（1）用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；（2）用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；（3）用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。思考：1.如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)目的基因——载体连接物、载体——载体连接物、目的基因——目的基因连接物。思考：2.如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？双酶切-G-CTTAA-A-TCTAG2.克隆载体与表达载体克隆载体表达载体用于大量扩增外源DNA的载体使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体作为基因表达载体，除了目的基因、复制原点外，还需要哪些元件呢？①区别②构件启动子、终止子和标记基因（常用是抗性基因）例(2016·全国丙，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_____________________________________________。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是___________________。Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（三）将目的基因导入受体细胞接受目的基因的细胞称为受体细胞。根据受体细胞类型可选择不同的基因导入方法1.将目的基因导入微生物细胞微生物（常用大肠杆菌）①优点：繁殖周期短；体积小易于培养操作；多为单细胞；遗传物质相对较少②流程：大肠杆菌低温CaCl2感受态细胞溶于缓冲液中的重组DNA分子转化——CaCl2处理法2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法操作程序：取受精卵显微注射移植到同期发情的母畜子宫内为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体3.将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法将目的基因插入

中，用

转化农杆菌，再让农杆菌的

植物细胞，目的基因会随T-DNA整合到植物染色体DNA中，最后通过

技术可培育出转基因植物。

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程①转化：②农杆菌特点：农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞后，能将

上的______（___________）转移到被侵染的细胞，并且将其_________________________；Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA