中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分布特点

中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分布特点【摘要】目的了解国内Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者基因缺失的分布特点。方法用12对引物以多重PCR检测与56例DMD/BMD患者，分析缺失型患者抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因缺失的断裂点分布，并结合国内文献报道的221例病例资料，分析9对引物的总检出率及各引物的最佳组合。结果国内dystrophin基因缺失断裂点72%位于44～51号内含子内，以44号内含子最多(22%)，50号内含子次之(17%),位于45～51号内含子内的断裂点是44号内含子的倍。7号内含子断裂较少，仅4%的断裂点位于该内含子。9对引物的总检出率为48%，其中5对引物的总检出率为46%。两对引物的最佳组合为48号和17号，可检出35%的患者。结论国内dystrophin基因44～51号内含子高度不稳定，容易发生断裂。7号内含子可能不是国内dystrophin基因缺失断裂的高发区域。在国内5对引物的总检出率接近9对引物，48号和17号外显子的二重PCR扩增对于全国范围内DMD/BMD的筛选，尤其是结合其他方法进行大范围的产前筛选，不失为一种可取的选择。

【Abstract】ObjectiveTounderstandthedistributionalcharacteristicsofdystrophingenedeletioninChinese56Duchenne/Beckermusculardystrophy(DMD/BMD)patientsweredetectedbytwelveprimersmPCR(9primersplusexon7,50,52)andthedistributionofthebreakpointsofdystrophingenedeletionwasanalyzed.Combiningwiththe221unrelatedDMD/BMDcasesreportedinthepublishedpapersinChina,weanalyzedthepositiveratiodetectedbythenineprimersmPCRandthebestprimerscombinationtodetectDMD/BMDAbout72%ofdeletionbreakpointsfellinintorns44～51intheChinese DMD/BMDpatients.About22%ofdeletionbreakpointsfellinintron44,17%inintron50,whereasthemajority(50%)werelocatedwithinthesegmentsencompassingintrons45～51.Only4%ofdeletionbreakpointsfellinintron7.NineprimersmPCRcoulddetect48%ofallthecasesofDMD/BMD,andfive(exons12,51,17,48,45)ofthesenineprimescoulddetect46%ofallthecasesofDMD/BMD.Thebesttwo-primercombinationwasexons48and17,whichcoulddetect35%deletionofalltheDMD/BMDIntrons44～51werehighlyunstableandpronetobreak.Intron7mightnotbearealdeletion“hotspot”intheChinesepopulation.InChina,thepositiverateofdeletiondetectionwithfiveprimersmPCRwasalmostthesameasthatwithnineprimersmPCR.Detectingdeletionofexons48and17mightbeapreferablechoiceiftheprenatalscreeningonawiderangeofpregnancieswouldbeneeded.

【Keywords】MuscutardystrophyGenedeletionPolymerasechainreactionDystrophin

抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因突变中55%～65%为缺失，5%～10%为重复，8%左右为小的缺失和插入，点突变占25%左右［1］。dystrophin基因缺失分布在不同民族有不同的特点，如在以色列，Duchenne/Becker肌营养不良症(DMD/BMD)患者dystrophin基因突变中缺失率较低［2］，而希腊人和保加利亚人dystrophin基因缺失的断裂点分布有其独特的特点［3，4］。我们利用12对引物(9对引物［5］加7、50和52号外显子扩增引物)检测了56例DMD/BMD患者，分析了缺失型患者dystrophin基因缺失的断裂点分布。并结合国内文献报道，共分析了274例无血缘关系的DMD/BMD患者9对引物检测的总检出率及各引物最佳组合。

资料和方法

一、资料

56例DMD/BMD患者均来自我院神经遗传病专科门诊，其中BMD5例。所有患者均为男性，年龄8个月至30岁。患者中有6例两两之间有血缘关系。53例无血缘关系的病例中12例有家族史或同胞发病，占23%。除1例8个月男婴为症状前诊断外，其余患者均有典型临床表现并经肌电图、肌酶谱检查证实。此外，结合国内文献221例资料，分析9对引物的总检出率。

二、PCR扩增

9对由Chamberlain设计的引物［5］由中山医科大学遗传病学教研室提供，为了解dystrophin基因缺失在中央缺失热区的断裂点，我们根据Beggs等［6］的设计合成了50、52号外显子扩增引物。将以上11对引物分为5对、4对、3对三组：5对引物为12、17、45、48、51号外显子扩增引物，4对引物为4、8、19、44号，3对引物为50、51、52号。每次扩增均同时设空白和正常对照。缺失的外显子再以单一引物PCR扩增验证1次。为了解7号内含子的断裂情况,我们合成了7号外显子扩增引物，引物序列7F：GCATGGAAGTAAATCTCATGGAAC；7R：GTGTAG-AAATGACAAGTCTCAGATG，扩增产物为279bp。

结果

56例患者中28例至少有1个外显子缺失。53例无血缘关系的患者中27例有基因缺失，总检出率为51%。累及中央缺失热区的缺失24例，总检出率为45%,占检出病例的89%。根据检测结果，在27例缺失的54个断裂点中，72%的断裂点位于44～51号内含子，50%的断裂点位于45～51号内含子。确定位于7、44、50和51号内含子内的断裂点共30个，22%、17%、13%的断裂点分别位于44号、50号、51号内含子。7号内含子断裂较少，仅4%的断裂点位于该内含子。

结合文献资料［7-14］,274例DMD/BMD患者9对引物的总检出率为48%。对207例有完整资料的病例分析表明，48号外显子缺失最常见，45、51、17号外显子次之，它们各自的总检出率分别为28%、20%、16%、10%，分别占9对引物检出人数的57%、42%、33%、22%。4、8号外显子缺失少见，仅占总检出率的1%、5%。两对引物的组合以48号和17号组合检出率最高，总检出率为35%，检出人数占9对引物检出人数的73%。3对引物的最佳组合为48、45和17号，总检出率为41%，占9对引物检出人数的84%。4对引物的最佳组合为48、17、45和51号，总检出率为44%，占9对引物的91%。5对引物总检出率可达46%，占9对引物检出人数的96%。

讨论

dystrophin基因突变55%～65%为缺失，且主要分布在两个区域。中央缺失热区位于44～53号外显子区域，占所有缺失的70%左右；5′端缺失热区位于3～19号外显子，占20%左右。Chamberlain等［5］的9对引物可检测出80%的缺失患者，Beggs等［6］又增设了另9对引物，发现这18对引物可检测出98%的缺失患者。以上研究为临床检测提供了极其重要的信息。

dystrophin基因长达Mb，其所包含的79个外显子仅占整个序列的%，因而内含子大是其显着的特点。早期的研究表明，该基因缺失断裂点的分布是非随机的，因而许多学者认为该基因最长的2个内含子(44和7号)是该基因断裂的高发区。

本资料显示9对引物的总检出率为51%，与国外研究结果相似［13］。但对缺失断裂点的分析发现，72%的缺失断裂点位于44～51号内含子内，以44号内含子最多，50、51号内含子次之(分别为17%、13%)。约50%的断裂点位于45～51号内含子内，是44号内含子的倍。国内274例DMD/BMD患者9对引物的缺失总检出率为48%，缺失外显子以48号最为常见，45、51号次之。

以上结果与部分文献报道相似。Danieli等［15］报道，在部分欧洲人群中位于45～51号内含子内的断裂点是44号内含子的倍。在保加利亚人，dystrophin基因的总缺失率与其他文献报道相似，但%的断裂点位于45～51号内含子内，以50号内含子最多,而断在44号内含子内的比率为%［4］。希腊［3］和土耳其［16］也发现，在50号内含子内断裂点有聚集现象。45～51号内含子的总长度不超过270kb，仅较44号内含子大30%左右。50号内含子长约45kb,长度仅为44号内含子的1/4。提示至少在国内及以上人群中，不仅44号，45～51号内含子也是高度不稳定的，尤其是50号内含子。在以上人群中，这一区域的内含子容易发生断裂。

本资料中7号内含子断裂较少，仅4%的断裂点位于该内含子。对其他资料［7-14］统计结果也发现，国内DMD/BMD患者4号和8号外显子缺失少见，仅分别占1%、5%。这一结果低于国外的报道(%)［17］，提示7号内含子可能不是国内dystrophin基因缺失的断裂高发内含子。7号内含子是否是中国人真正的缺失热区，尚有待进一步研究。

对国内207例完整资料的分析表明，国内5对引物的检测效果与9对引物接近，其总检出率达46%，占9对引物的96%。我们认为,在国内如果受条件限制，可以考虑用5对引物来替代9对引物检测或先行5对引物检测。对于条件较差的医院可以根据本研究统计的引物最佳组合，酌情选择检测引物。行48号、17号外显子的二重PCR扩增，可筛选出35%的DMD/BMD患者，对于全国范围内DMD/BMD的筛选，尤其是结合其他方法进行大范围的产前筛选时，不失为一种可取的选择。

参考文献

1RobertsRG,GardnerRJ,BobrowM.Searchingforthe1in2400000:areviewofdystrophingenepointmutations.HumMutat,1994,4:1-11.

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