核酸和蛋白质分析技术

核酸和蛋白质分析技术第一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第一节核酸分析技术讲述内容：

1、核酸电泳

2、杂交技术

3、PCR技术

4、基因芯片第二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一一、核酸电泳（一）DNA的凝胶电泳凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。

1.琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段;

操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高

2.聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段;

效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA

用于核苷酸多态性的分析

第三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一琼脂糖凝胶电泳的基本过程材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。

基本过程：制胶放入电泳槽中并加入电泳缓冲液取出梳子将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中一定电压条件下电泳合适的时间后停止电泳取出凝胶进行溴化乙锭染色凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果

注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套第四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（％，W/V)DNA分子的有效分离范围（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2第五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：

1DNA分子的大小2构象3凝胶浓度4电压5缓冲液第六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中

DNALadder的形成PCR产物的琼脂糖电泳第七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析第八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一特殊的凝胶电泳倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分离分子量10～2000kb的DNA分子；钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可分离大于107bp的DNA分子

第九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。

（二）RNA电泳第十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一二核酸杂交技术（一）SouthernBlot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。

第十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

SouthernBlot操作步骤：DNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色第十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

（二）NorthernBlot

第十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一操作过程

mRNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光第十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（三）探针标记技术1标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素

2、标记方法

（1）切口平移法

（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法

32P、35S和3H

第十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一三PCR技术PCR(Polymerasechainreaction)是用一对寡聚DNA作为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。

Dr.KarryMullis1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖；目的:

用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。第十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（一）原理：双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA－－－变性↓与一对寡核苷酸引物（5’，3’）降低温度退火

DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火↓适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA－－延伸↓第二轮：变性—退火—延伸呈指数增长理论值：一轮一倍10轮103=1000倍

20轮10630轮109

理论模板扩增30轮1ng1g

实际模板扩增30轮1ng10g第十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一1TaqDNA聚合酶：水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶①5’3’DNA聚合酶活性；②无3’5’外切酶活性，

35轮0.25%错配，与原始模板有差别；最适聚合酶温度72℃，选择72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min

变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性（二）基本要素第十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一pfuDNA聚合酶

耐热5’3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精确度：pfu>Taq

但pfu扩增效率通常比Taq酶略差文献报道：Taq+pfu会起到较好效果

第二十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

2.引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每条10-50pmol/100l

◆设计原则：（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同

3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同正链5'—————3'——上游Primer

——下游Primer负链3'—————5'

例如：

IL-3正链

5'GCTCCATGACCCAGGCGATCTTTTGAGTCCAA3'

负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'

上游~：与其相同下游~：先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'

所以负链Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'第二十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer

一般不要超过3个互补bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

第二十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

修饰如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果

突变：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸

（4）Primer5’未端可修饰、突变:第二十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

（5）primer5’端增加碱基

①内切酶识别点：

（G）GAATTC

GCTCCATGACCCAG

↑保护bp

对PCR产物cloning有很大好处便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同

EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10

如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆∵未切开，连接不上

第二十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一②ATG起始密码③TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。第二十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

3.模板：

可选：DNAmRNA→逆转录→cDNADNA包括：质粒噬菌体染色体DNA

较小较大①目的gene是单拷贝变性较易变性较难②非常大，变性难模板用量

Plasmid:lngChromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染第二十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一4.dNTP：四种脱氧核苷酸，基本原料终浓度：50M注意：不稳定，保存时间长会失效第二十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+Taq：较少，Mg2+

对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍外界影响：

EDTA鳌合Mg2+∴选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+

结合，降低Mg2+

有效浓度。∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的

Mg2+浓度第二十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（1）变性温度：94-95℃Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑

（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：500nt1min500nt－－3min一般：40－60sec

6.温度和时间：第二十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（三）PCR技术的应用1.基因检测：2.基因克隆化3.DNA突变4.DNA序列分析第三十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一四、基因芯片利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究背景资料

基因芯片（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ）就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。第三十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一操作流程

（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）；（2）靶基因样品的制备；

靶基因的制备：RT-PCR（设实验组和对照组）标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似

封闭预杂交杂交洗脱（4）杂交信号的检测与结果的分析

激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析

第三十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一基因芯片的应用用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究

举例：美国斯坦福大学Davis等用PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库中得到了1046种cDNA片段，制成芯片，然后与热处理的T淋巴细胞和未处理的T细胞种提取的mRNA反转录出的单链cDNA片段杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，6个是被热抑制的。经序列分析证实，其中3个是未报导的新基因。第三十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第二节蛋白质分析技术讲述内容：一、WesternBlot

二、ELISA三、免疫荧光技术四、免疫组织化学技术

五、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术第三十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一一WesternBlot1原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

第三十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一2操作过程SDS电泳转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影第三十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

Hours04816

WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrol

第三十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一0h4h8h16h

WesternBlotanalysisofcytochromeCrelease.

Cytochromecreleasefrommitochondriatocytosolingossypol-treatedIM-9/Bcl-2cells.Cellsweretreatedwith10μMgossypolfordifferenttimes,cytosolandmitochondrialproteinweresubjecttoSDSfollowedbyimmunoblotwithcytochromecspecificantibody.Cyto-CX-Protein第三十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一3注意的问题（1）蛋白质电泳常用SDS：单一亚基组成的蛋白质非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套第三十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（2）转膜戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极排去滤纸、胶和膜间的气泡。电转时间：100V1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置第四十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（3）封闭用5％脱脂奶粉或3％BSA（含0.1％Tween20TBS或PBS配制）时间：室温2h或4ºC过夜第四十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（4）显色或显影显色辣根过氧化物酶：底物为DAB碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT化学发光显影最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定第四十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

（5）膜的再利用

化学发光后的硝酸纤维素膜用StrippingBuffer洗涤后（洗涤Buffer:62.5mmpH6.7的Tris-HCI含2％SDS和100mm的－2ME）用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交第四十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

1原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。二、ELISA第四十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一ELISA常用的酶和底物

辣根过氧化物酶，底物为OPD,深桔黄色，检测波长492nmTMB，蓝绿色，检测波长450nm

碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）,黄色检测波长405nm

ELISA各步骤的反应时间

包被：24－36h，蛋白浓度为1－5ug/ml

封闭：37ºC2h或4ºC过夜（3％BSA）样本反应时间：37ºC45min-1h

酶标抗体反应时间：37ºC45min-1h

显色时间：15min(避光）设对照可以一次包被多块板，冻存备用

第四十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一2类型（1）间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。方法：抗原包被封闭待检抗体洗涤酶标二抗洗涤显色反应终止反应ELISAReader检测OD值第四十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一(2)双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用的方法。

只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体单克隆抗体＋单克隆抗体

后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。第四十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一双抗体夹心法测抗原的方法：捕获抗体包被封闭（3％BSA）待测抗原洗涤（含0.1％Tween的PBS)酶标单抗或多抗洗涤显色检测第四十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一(3)竞争法测抗原1）抗体固相测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。方法：抗体包被封闭同时加入待测抗原和酶标抗原洗涤酶底物显色ELISAreader检测第四十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一2）抗原固相测抗原其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法:a:抗原包被96孔板；b:封闭;c:待测抗原与抗体反应一定时间；d:加入96孔板

e:洗涤f：加入酶标二抗

g：洗涤h：显色和检测如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测第五十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第五十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（4）IgM抗体的检测1）间接法：间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。方法

a:抗原包被96孔酶标板；b:封闭;c:待测血清与A蛋白反应一定时间后离心

d:吸取上清液加入96孔酶标板

e:洗涤f：加入酶标抗IgM的抗体

g：洗涤h：显色和检测第五十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一2）捕获包被法（夹心法）先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM)。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。方法：

a:抗人IgM抗体包被96孔酶标板；b:封闭;c:加入待测血清；d:洗涤96孔酶标板

e:加入相应抗原f：加入抗原特异的酶标抗体

g：洗涤h：显色和检测第五十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（5）ABS-ELISA技术（AvidinBiotinsystem-ELISA原理亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。操作过程：抗原包被封闭待检标本生物素化抗体洗涤酶标记亲和素洗涤加底物显色和检测第五十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一三免疫荧光技术

利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。第五十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（一）细胞膜蛋白分子的检测原理：细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量第五十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一1直接法：细胞＋荧光素标记的抗CD分子的抗体4ºC反应30-60min荧光显微镜观察或流式细胞计分析。2间接法：细胞＋抗CD分子的抗体4ºC反应30-60min

荧光素标记的二抗4ºC反应30-60min荧光显微镜观察或流式细胞计分析悬浮细胞：用PBS洗二次后再做染色贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色1细胞膜CD分子的检测第五十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

2AnnexinV检测技术

(检测细胞凋亡的一个常规指标)磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

原理第五十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第五十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一样本处理和染色方法

1悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ulBindingBuffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

第六十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第六十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第六十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（二）细胞内蛋白分子的检测细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白TFAR19的检测等。操作过程：（1）直接法：

细胞3％多聚甲醛固定和渗透化封闭荧光素标记的抗体洗涤荧光显微镜观察或流式细胞计分析（2）间接法：细胞3％多聚甲醛固定和渗透化封闭针对蛋白的特异抗体洗涤荧光素标记的二抗洗涤荧光显微镜观察或流式细胞计分析第六十三页，共八十一页，编辑于2023年，星期一凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

第六十四页，共八十一页，编辑于2023年，星期一

1悬浮细胞的染色：

（1）收获正常和诱导凋亡的细胞（0.5~1×106），PBS洗2次，

（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。

（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，（4）加入200ml胎牛血清，室温反应30min。

（5）加入FITC标记的TFAR19单抗，4°C反应30min

（6）荧光细胞洗液洗2次，荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。

2：贴壁细胞的原位染色

（1）贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中（内有洁净盖玻片），让其爬片生长，待长到50%~80%满时，凋亡诱导剂处理细胞。

（2）将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色，染色步骤同上。

（3）将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油（5ul）的载玻片上，荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。

第六十五页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第六十六页，共八十一页，编辑于2023年，星期一第六十七页，共八十一页，编辑于2023年，星期一原理：是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。四免疫组织化学技术第六十八页，共八十一页，编辑于2023年，星期一免疫组化染色技术的分类免疫荧光法（Immunofluorescencetechnique）免疫酶法（Immunoperoxidasetechnique）免疫金银法（（Immunogoldtechnique）ABC法（Avidin-BiotinComplex）第六十九页，共八十一页，编辑于2023年，星期一五蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术第七十页，共八十一页，编辑于2023年，星期一1GST融合蛋白进行Pulldow实验

（1）原理细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

两种应用：

1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用

2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用

第七十一页，共八十一页，编辑于2023年，星期一（2）方法：

1）GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a,单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c,体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）

2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应4ºC2h3）离心弃上清

4）沉淀加入2×

蛋白LoadingBuffer煮沸，离心

5）取上清进行SDS电泳，

6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行第七十二页，共八十一页，编辑于2023年，星期一GST-P