第七章旋光色散和园二色光谱

第七章旋光色散和园二色光谱第一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四OVERVIEW

1.Amoleculeisopticallyactiveifitinteractsdifferentlywithleftandrightcircularlypolarizedlight.Thisinteractioncanbedetectedeitherasadifferentialchangeinvelocityofthetwobeamsthroughthesampleopticalrotatorydispersion(ORD)orasadifferentialabsorptionofeachbeamcirculardichroism(CD).第二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四2.ORDspectraarecharacterizedby[]，

whichisthespecificrotationatagivenwavelength，

orthemolarrotation[].Bothhaveunitsofdegreecm2dmol1.CDspectraarecharacterizedby

A(thedifferentialabsorptionofthetwobeams)orthemolarellipticity[]m，

whichatagivenwavelengthisrelatedtoA.CDorORDbandsareoftenreferredtoasCottoneffects.Thesecanbepositiveornegative.第三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四3.CDismorefrequentlyusedthanORDbecauseofsuperiorinstrumentationandtheshapesoftheCDcurves.

4.Veryfewchromophoresareintrinsicallyopticallyactive;thosethatareactiveincludetheamidesanddisulfidecystineinproteins.Mostopticalactivityofchromophoresarisesfromopticalactivityinducedbyinteractionswithasymmetricallyplacedneighboringgroups.第四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四5.OneofthemainapplicationsofCDspectraisbasedontheirsensitivitytothesecondarystructureofproteins.Otherusesincludedetectionofconformationalchangesandmeasurementofligandbinding.

6.Opticalactivitycanalsobeinducedbytheapplicationofamagneticfield，

whichperturbstheenergylevelsofthesystem.Thisisthebasisofmagneticcirculardichroism(MCD).UnlikeCD，

MCDislargelyinsensitivetomolecularconformation，

butitissensitivetothetotalconcentrationofMCDactivechromophoresandtheirlocalenvironment.第五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.1引言早在十七世纪，Huggens就发现了光的偏振到了十九世纪，偏振光开始用于分子的旋光现象的研究Biot1881年发现石英能使偏振光的偏振面旋转，在松节油等液体和某些气体中也发现了这种效应。Biot在发现旋光现象的同时，还观察到了电气石的园二色性。后来将旋光色散与园二色性这两种现象称为科顿效应。

第六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四十九世纪中期，许多旋光性的定律开始公式化，并对十九世纪末有机立体化学和有机结构理论的发展起到了直接的推动作用。1934年，Lowry出版了第一本完整的有关旋光色散的书”OpticalRotatoryPower”。1953年Djerasi实验室建立了第一台偏振光检测仪，从此ORD开始广泛地用于研究有机分子和生物大分子。六十年代，园二色谱逐渐取代旋光色散方法，成为研究生物大分子溶液构象的有力工具。第七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.2原理7.2.1平面偏振光、园偏振光和椭圆偏振光当一束平面偏振光(PlanePolarizedLight)通过某种物质传播时，若出射光的偏振面相对于入射光的偏振面旋转一定的角度，这种物质称之为"光学活性物质

(Opticallyactivesubstance)"或"手性物质"(chiralsubstance)"。这种性质则称为"光学活性"(opticalactivity)或"手征性

(chirality)"。光学活性物质除使入射到它上面并通过它传播的平面偏振光的偏振面旋转一定的角度之外(称为"旋光")，还会存在光吸收各向异性，称为"园二色性

(circulardichroism)"。第八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四活的生物体所含有的分子差不多都具有光学活性。小分子的光学活性来源于其结构的不对称性，特别是分子中存在的不对称的碳原子以及这些原子对附近生色团(chromophore)的影响。生物大分子的构象与其所表现出来的生物活性有着密切的关系，因此旋光性和园二色性测量技术是研究生物大分子构象及其功能间关系的重要手段。第九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四光是横波，其电场矢量E和磁场矢量H与光传播方向均垂直。若光波电矢量E(以及磁矢量H)取所有可能的方向，而没有一个方向较其他方向占优势，这种光称为"自然光"(图1(a))。由于光波产生感光作用主要是电场E引起的，因而一般就把电场矢量E为光波的振动矢量。该振动矢量与光波传播方向所决定的平面叫做振动面。当自然光入射到某些材料后，出射光就变为其振动面确定的光，叫做"平面偏振光"或"线偏振光"(图1(b))。平面偏振光的电矢量E的方向和电传播方向所决定的平面，叫偏振面

(Polarizedplane)。第十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四图1.Directionsoftheelectricvectorinpolarizedandunpolarizedlight.Inunpolarizedlight(a)，orpartlypolarizedlight(c)，theoscillationstakeplaceatallanglesperpendiculartothedirectionoftravel;inpolarizedlight(b)theyarerestrictedtooneangle.第十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四如下图所示两个频率和振幅相同，偏振面互相垂直的平面偏振光，如果其相位差90，则它们合成为一个"圆偏振光"。

图2左旋园偏振光

第十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四图3右旋园偏振光第十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四图4椭园偏振光

第十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四E0ji

一束平面偏振光可以分解为两束振幅、频率相同，旋转方向相反的圆偏振光(Circularpolarizedlight)，如图所示E=E0cost=jE0cost=Er+ElEr＝1/2(+iEsinωt+jEcosωt)(5)El＝1/2(iEsinωt+jEcosωt)(6)其中E为平面偏振光电场矢量的振幅，ω为其角频率，i和j为ｘ轴和ｙ轴上的单位矢量。右旋园偏振光的电场矢量Er

之端点在空间的轨迹是以光的传播方向为轴的左手螺旋，而左旋园偏振光El之端点在空间的轨迹是以光的传播方向为轴的右手螺旋，它们的振动面随时间而旋转。

一个平面偏振光可以用下面的方程表示:E=E0cost=jE0cost

i，j分别为X，Y座标轴方向上的单位矢量。第十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.2.2旋光(OpticalRotation)、旋光色散(OpticalRotatoryDispersion，ORD)和圆双折射(CircularBirefrigence)。光在通过不同物质时，其传播速度会发生改变，定义光在真空中的速度C0与在某种物质中的速度v之比为折射率n，即n=C0/v。如果某种物质对于左旋偏振光和右旋偏振光的折射率nl≠nr，则左旋光和右旋光的旋转速度会有所不同，它们的和与原来没有样品时相比旋转了一个角度(见图)，这种现象称为"旋光"。面对入射光，使入射光的偏振方向顺时针旋转的物质叫"右旋物质"，使入射光的偏振方向逆时针旋转的物质叫"左旋物质"，习惯上用"+"号表示右旋物质，用""号表示左旋物质。

第十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四对于光学各向异性物质，它对左旋园偏振光和右旋园偏振光的折射率nl和nr是不同的，二者之差Δｎ=nl

nr

称为圆双折射。由于

c:为真空中的光速，v:为光在介质中的速度，因此某种物质存在圆双折射，入射的平面偏振光之左旋分量和右旋分量将以不同的传播速度通过介质，通过该物质后，两者之间存在一定的相位差，若该介质对左旋分量和右旋分量的吸收相同，出射的两束圆偏振光分量将重新合成平面偏振光(而不是圆偏振光或椭圆偏振光），如图6（b）所示，其偏振面与入射平面偏振光之偏振面间的夹角为α

。第十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四图6(a)园二色的产生：样品对左旋L和右旋R两个园偏振分量吸收不同，合成为椭圆偏振光；（b）园双折射和旋光现象：样品对左旋和右旋偏振光的折射率不同即L和R在样品中的速度不同。合成的平面偏振光之偏振面旋转了α角。。第十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四经过推导可得到:(弧度)(度)

式中ｌ为样品厚度，λ为光波波长。由此我们看出，旋光现象就是一种圆双折射，旋光性的本质就是旋光物质具有两个不同的折射率。第十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四平面偏振光通过样品后其偏振面旋转的角度obs。与光穿透的样品厚度l、溶液样品中旋光性物质的浓度c成正比(在一定的浓度范围内)，且与该光波长λ、样品温度T有

比例系数[]T称为比旋

(Thespecificrotation)或旋光率。第二十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四旋光可用比旋[]T表示，也可用摩尔比旋(theMolarRotation)[]T

或克分子旋光度表示，二者间的关系为:

其中MW是溶质的分子量，单位为克/摩尔，摩尔比旋的量纲为度厘米2分摩尔－1。l为光径，单位为分米(dm)，C为浓度，单位为克/毫升。第二十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四

在生物大分子的研究中，还常用平均残基旋光度

(averageresiduerotation)[ｍ]λ，其定义为

MRW[ｍ]λ＝[]λ100

其中MRW为平均残基分子量(meanresidueweight)，即蛋白分子量与残基数之比

MWMRW＝残基数

对一般的蛋白质分子，该值约为110-115。第二十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四对于同一物质，比旋[]或摩尔比旋[φ]与入射偏振光的波长λ有关，比旋[]或摩尔比旋[]与波长间的函数关系称为旋光色散。

第二十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.2.3圆二色性(CircularDichroism)和椭圆率(ellipticity)当一束光穿过样品时，光的强度呈指数规律下降，服从Beer-Lambert定律。

log10(I0/It)=Cl

其中I0是入射光的强度，It是穿过样品后的光强度，C是样品浓度，l是光径，是消光系数(extinctioncoefficient)。令A=log10(I0/It)=ClA称为吸收度(absorbance)或光密度(opticaldensity)。第二十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四当一束平面偏振光通过光学活性介质传播时，由于介质对二分量的消光系数l和r不等，即对左旋光和右旋光的吸收不同，一束平面偏振光通过该样品后，其左旋分量和右旋分量强度不再相同，它们的和就不再是平面偏振光而是椭圆偏振光。这种现象就叫做“圆二色(circulardichroism)“（图6a）。第二十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四由于存在圆二色性，平面偏振光通过光学活性介质后，两圆偏振分量电场矢量的大小不同了(实际上，由于同时存在圆双折射，因此二者位相也不同)，这样两个大小不同的圆偏振光合成的不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光(ellipticallyPolarizedlight)，其电场矢量端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭形螺旋(ellipticalhelix)，其振动面随时间也是连续旋转的(图4)。第二十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四我们可以通过进一步的分析来理解园二色现象。如果l≠r，则通过光学活性物质的样品后，左旋分量的振幅不再等于右旋分量的振幅。假定左旋分量<右旋分量，即El<Er，即Er>El

Er

＝1/2(+iErsinｔ+jErcosｔ)El＝1/2(iElsinｔ+jElcosｔ)Er+El＝i(ErEl)sinｔ+j(

Er+El)cosｔ这个光的电场矢量的端点轨迹是一个椭圆，即通过光学活性物质的样品后，左旋和右旋偏振光的和不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，椭圆的长轴在j方向上，长轴为Er+El，短轴在i方向上，短轴为ErEl

。

第二十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四圆二色可用吸收度差ΔA或消光系数差来表示:ΔA=AlAr称为圆二色性

(ＣＤ)。有的文献用摩尔消光系数表示圆二色性Δ

=l

r＝(AlAr)／C·l

上式中l和r分别为左右旋分量的摩尔消光值(molarabsorbance)。第二十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四园二色性的大小也可用椭圆率来表示。椭圆偏振光电场矢量端点在空间的轨迹投影到垂直于光传播方向的平面上为一椭圆，此椭圆的短轴(theminoraxis)a与长轴(themajoraxis)b之比的反正切称为椭圆率:aθ＝tg-1

（弧度）

b由理论分析可推出椭圆率和圆二色性间的关系为

180θ＝2.303(AlAr)

(度)4π第二十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四与旋光度对应，在实际工作中，还常用比椭圆率[ψ]λ（specificellipticity）、摩尔椭圆率[θ]λ(molarellipticity)和平均残基椭圆率[θ]λMRW（themeanresicueellipticity）:[ψ]λ=

其中θλ为测得的椭圆率，单位为度，MW为分子量，单位为克/摩尔，MRW为平均残基分子量，l为光径，单位为分米，C为浓度，单位为克/毫升，[θ]的单位是度·厘米2·分摩尔-1。第三十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四当不存在圆二色性时，即l=r时，椭圆的短轴为零，变为在长轴方向的直线，这正是前面讨论过的平面偏振光，不过偏振面相对于入射光偏振面旋转了角度φ。第三十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7．2．4科顿效应(Cottoneffect)

在光学活性物质的整个吸收带内，其旋光色散曲线(ORD)呈S形，而相应的圆二色性曲线(CD)呈钟形，这种ORD在吸收带附近的异常效应和圆二色性在吸收峰处具有极值的现象称为科顿效应(图7)。ORD曲线在较长波长一侧有一峰的科顿效应称为正的科顿效应，而此侧有一谷的称为负的科顿效应[图7]。正的科顿效应具有正的CD曲线，其峰位在S形ORD曲线的凸到凹的转折点。第三十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四图7(a)

正的科顿效应(b)负的科顿效应（参考书图104）

第三十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四

从图中可以看出：CD谱带比ORD有更好的分辨率，但ORD谱带的两翼看到的信息可能是CD无法直接看到的。此外，ORD谱是一种色散曲线（反映了折射率随波长的变化），因此它与折射系数的符号在吸收峰附近的变化有关。第三十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四

从图中还可以看出：CD谱带比ORD有以下三个优点：（A）CD谱带比较容易辨认，因为一个有光学活性的电子跃迁，其ORD是一个色散曲线，而CD谱只有一个单相的谱峰。（B）ORD色散曲线分布的波长范围比CD谱宽，即其分辨率不如CD谱高。（C）CD谱在检测技术上比ORD更方便。这一点将在仪器部分介绍。第三十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.2.5旋光色散与园二色谱的关系：Kronig-Kramer变换式CD谱与ORD谱是相互关联的，实际中，这两种现象总是同时发生的，它们之间的关系可以用Kronig-Kramer变换式表示:

２ ()2[Φ]λ＝0[θ()]d

π 2

－()2

2()2[]λ＝

0[()]

d

2

－()2

第三十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.2.6THEPHYSICALBASISOFOPTICALACTIVITY

AswediscussedinChapter2,transitionsfromthegroundstatetotheexcitedstateinvolveadisplacementofcharge.Alineardisplacementwithanelectrictransitiondipolemomentisdenotedby.Thetransitioncanalsohaveacircularcomponent;this(rotatingcurrent)thengeneratesamagneticdipolemomentmperpendiculartotheplaneofthecircularmotion(seeFigure8(a)).

第三十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Opticalactivityrequiresafiniteandafinitem.Thiscorrespondstoahelicaldisplacementofcharge.Theresultisthatleftorrightcircularlypolarizedbeamstheninteractdifferentlywiththemoleculesinsolution.Theseinteractionsdonotaveragetozeroeveninmoleculesrandomlyorientedinsolution(compare"LinearDichroism").(Themagnitudeofthetransitionisproportionaltothevectorproductofandm).

第三十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Therequiredhelicaldisplacementofchargemayarisefromtheintrinsicnatureofthechemicalbonds,forexample,inann*transition(seeFigure8(b)).Chromophoresthathaveintrinsicopticalactivityareoftentermedasymmetric.Therequiredhelicaldisplacementofchargemayalsoarisefromaninducedeffectbecauseoftheenvironmentofthemoleculeundergoingthetransition.TheresultingopticalactivityisthenoftenreferredtoasanextrinsicCottoneffect.第三十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Figure10.6(a)Ahelicaldisplacementofchargecanbeconsideredtocomprisealineardisplacementplusacirculardisplacement.(b)Rotationandtranslationofchargeinanorbital.

第四十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四OPTICALLYACTIVECHROMOPHORES

Opticalactivityisobservedonlywhentheenvironmentinwhichatransitionoccursisasymmetric.Aninherentlyasymmetricchromophore,suchasthepeptidebond,isalwaysopticallyactiveirrespectiveofthesurroundinggroupswhichcan,however,modifyitsopticalproperties.第四十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Incontrast,anyopticalactivityfrominherentlysymmetricchromophoresisinducedandresultsfrominteractionswithasymmetricallyplacedneighboringgroups.Thesignandmagnitudeoftheinducedopticalactivity(Cottoneffects)ofaparticularchromophoredependonthelocalenvironment.

第四十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Veryfewchromophoresareinherentlyopticallyactive.Inproteins,apartfromtheamidechromophores(240nm),onlythedisulfidecystineisintrinsicallyopticallyactive.ThepositionsoftheCDbandsfromthedisulfidearefoundintherange240-360nm.TheirCDspectraarecomplextointerpretanddependontheSSdihedralangleandtheinteractionswithneighboringgroups.TheyarenotusuallyresolvablefromtheinducedCDbandsofthenormallyopticallyinactivearomaticsidechains,whichoccurintherange250-310nm.Inducedopticalactivityisalsoobservedinthehemeabsorptiontransitionsofmosthemeproteinsandforthemetalabsorptionbandsinmostmetalloproteins.

第四十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Innucleicacids,theindividualbasesofDNAandRNAarenotopticallyactive,buttheirincorporationintonucleosidesornucleotidesresultsininducedopticalactivity.Theseeffectsdependonthenatureofthebaseandtheglycosidiclinkage.第四十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Carbohydratesgenerallyabsorbonlyinthefarultraviolet,butasinstrumentationisimproved,therewillbemoreapplicationsinthisfield.Inpolysaccharides,boththenatureoftheindividualsugarsandthelinkagesbetweenthemareimportantindeterminingtheopticalactivity.第四十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四三、仪器原理

物质光学活性研究，既可以通过旋光色散(ORD)谱的测量进行，也可以通过园二色性(CD)的测量进行。但是，CD谱较ORD谱有明显的优点，其谱带与吸收带重迭，分子中不同生色团对于谱的贡献比起在ORD中可以更容易分辨，而在ORD中任意波长处的旋光性是分子中所有生色团色散贡献之和。其科顿效应又与吸收峰不一致，解释起来有较大困难。第四十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四由于科顿效应曲线总是发生在光学活性物质的吸收带附近，这时光学活性物质也总是表现出园二色性，因此近年来园二色性研究已基本取代了旋光色散研究，这里也仅介绍园二色性测量的仪器原理。园二色性测量，实际上是测量样品对左旋偏振光和右旋偏振光吸收率的差值A=ALAR第四十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四由公式＝2.303(ALAR)

可以计算出椭圆率，进而由公式可以得到摩尔椭圆率。

第四十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四只要将频率、强度完全相同的左、右旋偏振光交替地通过样品，分别记录样品对它们的吸收值，由式A=ALAR即可得到该频率下的圆二色性和椭圆率的值，逐渐改变左右旋偏振光的波长，即对波长进行扫描，即可得到圆二色谱([]随的变化曲线)。第四十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四圆二色测量谱仪的结构框图第五十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四光源（S）一般为氙灯，功率在500W左右，在可见波段具有足够的光强，且称连续谱。紫外波段虽强度下降，但直至185nm，仍有相当的强度，是较理想的光源。单色仪（MC）的用途是使光源发出的各种波长的光按要求成为单一波长的光波。起偏器（P）的作用是使单色光成为平面偏振光。第五十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四调制器（M）受程序控制系统的控制，使透过的光以一定的频率交替地变为左旋和右旋园偏振光。一般来说，这种调制器是由某种压电晶体制成的晶片制成的，晶片两面镀上电极，两电极之间加上一交变电压，交变电压的电压值按照一定的频率周期性地变化时，晶片的厚度也随之变化。仪器的设计使交流电压的峰值处获得园偏振光。当电压通过其正、负峰值时，可以交替地得到左、右旋园偏振光。

第五十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四从调制器出来的左旋和右旋园偏振光通过样品后，由检测器（PD）进行检测，然后输入放大器（Amp.）和相敏检测器（PSD），由放大器出来的信号的直流分量和由相敏检测器出来的信号的交流分量在运算单元中进行计算，得到A，最后输入数据记录系统。

第五十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四A的测量和计算方法

前面已经介绍：A=ALAR

由于吸收率A＝式中I0为入射光强度，I为出射光强度第五十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四由于入射的左、右旋园偏振光的强度是相等的，因此I0L＝I0R由于IR与IL相差很小，A很难测定。实际仪器中是将平面偏振光引入调制器，调制器是加一高频交变电压。选择适当的交变电压和调制器，使得在交变电压的峰值处获得园偏振光，当电压通过其正、负峰值时，可以交替地得到左、右旋园偏振光。当光学活性的物质插入这园偏振光的光路中时，通过样品后的光强度随时间的变化如下图，强度变化的频率与外加电压的频率相同。

第五十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四如果AL>AR，则IR>IL，即通过样品后的右旋园偏振光的强度大于左旋园偏振光。当强度这样变化的光照射到光电倍增管上时，输出信号中含有AC分量IAC和DC分量IDC。IAC＝IR－ILIDC＝

第五十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四如果AL>AR，则IR>IL，即通过样品后的右旋园偏振光的强度大于左旋园偏振光。当强度这样变化的光照射到光电倍增管上时，输出信号中含有AC分量IAC(图中S)和DC分量IDC(图中IA)

。IAC＝IR－ILIDC＝第五十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四

当x<<1，第五十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四

这样，

第五十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四这样，求出就得到了A，也就得到了。

现代化的CD谱仪，只要将仪器调整到正常工作状态，置样品于光路中，启动仪器，即可自动进行波长扫描(在设定的频率区间)，得到CD谱。

第六十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4园二色谱的生物学应用举例第六十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1氨基酸和多肽的园二色性氨基酸分子内的紫外生色基团有吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键，咪唑基和羧基。当这些生色基团受到不对称碳原子或其它不对称结构的影响时，在它们各自的吸收区域里表现出圆二色性。研究氨基酸（主要是芳香族氨基酸和胱氨酸）以及它们的衍生物的CD性质，为研究蛋白质的CD谱提供基本的材料。同时，活性肽有重要的生理功能，因此肽的构象与功能的关系是重要的分子生物学课题。肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了许多重要的信息。第六十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1氨基酸的圆二色谱

7.4.1.1.1酪氨酸及其衍生物的近紫外CD谱酪氨酸及其衍生物在中性水溶液中的CD谱都在275nm左右显示CD峰。下图表示N-乙酸酪氨酸酰胺在水溶液中的CD谱。275nm左右的峰可正可负，视模型化合物以及所用溶剂而定。在水溶液中，CD峰处的椭圆值在＋660到－660间，比一般蛋白质中每个酪氨酸残基的CD贡献要小得多。第六十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四在有机溶剂中或在低温下，酪氨酸及其衍生物的CD峰值显著增大。Strickland等得到在低温下酪氨酸衍生物在有机溶剂中的CD谱，它们能清楚地显示酪氨酸CD谱的振动结构。但即便在室温下的水溶液中，一般酪氨酸衍生物的CD谱仍能显示一峰一肩（见下图），肩在峰的长波长一侧。溶剂组成的改变能影响谱带的位置。酪氨酸酚羟基如和其他质子受体组成氢键，则其CD谱会产生较大的红移。

第六十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第六十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四有些酪氨酸衍生物如N-乙酰-O-甲-酪氨酸乙酯在甲基环己烷中显示的CD谱形和其吸收谱形几乎完全一样，这说明这个化合物在此溶剂中以单一的构象子（Conformer）存在，但有许多模型化合物在溶液中以处于平衡状态的多个构象子存在。每个构象子的CD谱各不相同，有正有负。这些CD谱叠加起来，使得观察到的CD谱和吸收谱不一致的情形出现。酚羟基在碱性溶液中解离时，给出290nm以上的CD峰，峰形和峰位与其吸收谐相似。

第六十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1.2色氨酸及其衍生物的近紫外CD谱色氨酸的近紫外CD谱波长位置不大受溶剂条件的影响，一般在288-292nm间。溶剂对波长位置的影响，氢键的形成，使色氨酸及其衍生物的CD谱出现多种多样的情况。

第六十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1.3苯丙氨酸及其衍生物的近紫外CD谱由于苯环的高度对称性，苯丙氨酸侧链的CD值和上述两个芳香族氨基酸相比要小得多（见上图）。典型的苯丙氨酸模型化合物的CD谱在250－268nm间显示多个振动能级峰，尤其是268nm谱段，在室温下也能显示陡直的峰形。

第六十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1.4芳香族氨基酸以及它们衍生物的远紫外CD谱芳香族氨基酸以及它们的衍生物在250nm以下都有较强的CD贡献（下图），在这个区域内，苯丙氨酸的CD值和酪氨酸或色氨酸的相差不多，这和近紫外区域的情况形成对照。在酪氨酸的各种模型化合物中，226nm左右的CD峰总是正的。第六十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四，N-乙酰酪氨酰胺；---，N-乙酰苯丙氨酸胺；……，N-乙酰色氨酰胺．

第七十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1.5胱氨酸及其衍生物的紫外CD谱胱氨酸在水溶液中的CD谱中，近紫外区的负峰归属于二硫键，远紫外区的正峰归属于羧基贡献。和其他氨基酸的羧基贡献比，此正峰出现在较长的波长位置上，这可能是由于羧基和二硫键两个基团电子的相互作用，因而降低了羧基跃迁的能量；也可能由短波长区域的二硫键的强负CD峰的存在造成。胱氨酸的各种衍生物在水溶液中也显示相近的CD谱。

第七十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第七十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四二硫键是个具有不对称的生色基团，其正常的双面角接近90，有右手(P)和左手(M）两种旋转构象，在胱氨酸及其简单衍生物的溶液中，二硫键以几乎等量的P和M构象存在，因而它们的CD贡献互相抵消，即二硫键的固有不对称性并不对CD谱作出贡献。胱氨酸及其简单衍生物的CD谱只来源于不对称碳原子对二硫键的扰动。胱氨酸以晶体形式存在时，其二硫键只能采取某一种构象。对它的晶体所作的CD研究显示，波长最长的CD谱段可能与二硫键的手征性有关，即P构象显示正CD峰，M构象显示负CD峰。

第七十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1.6脯氨酸衍生物的CD谱核磁共振研究说明，X-Pro酰胺键存在反式一顺式异构现象。Madison和Schelman在对N-乙酸脯氨酸一N，N-二甲基酸胺（AcProDMA）的研究中，计算得到了反式与顺式的不同CD谱（见下图）。在水溶液中，AcProDMA主要以反式异构体存在，在非极性溶剂中主要以顺式异构体存在。上述结果对研究含有较多脯氨酸残基的肽的CD行为和多聚脯氨酸螺旋构象是很有帮助的。第七十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第七十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第七十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.1.1.7其它氨基酸的紫外CD谱在近紫外区，其它氨基酸均无CD贡献。在远紫外区，组氨酸侧链在213nm显示正峰；其余的氨基酸一般在200—210nm间显示正峰（下图），此为羧基所贡献，pH值升高使此峰蓝移。

第七十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第七十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四7.4.2用园二色谱研究多肽和蛋白质的二级结构7.4.2.1多聚氨基酸的远紫外园二色谱

利用旋光色散研究蛋白质的构象虽然有过较大的进展，但是存在两个困难。首先是在旋光色散谱中，科顿效应的极值都在吸收带极值的旁边，而不在吸收带的顶端，这对分析科顿效应的归属带来了困难。其次是残基本身有旋光值。要讨论ORD与构象关系时，有必要将残基的旋光扣除。但是我们只能测出氨基酸的旋光值而无法测出残基的旋光值，因此这种扣除是很困难的。这两个缺点是ORD自身的性质所决定的。第七十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Holzwarth与Doty发表了他们利用圆二色谱来测定多聚氨基酸和肌红蛋白的构象的工作以后，就逐渐有一些工作者从旋光色散转向用圆二色性来研究蛋白质。六十年代初，一般仪器只能测出波长大于250nm的CD谱，因此进展不大。后来仪器的改进能够测出波长范围在190—250nm的CD谱。由于这一区域的谱线与蛋白质分子主链构象有密切的联系，于是吸引了许多科学家应用CD来研究蛋白质。第八十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四相应于ORD的缺点，CD谱有许多有利的方面。首先它的峰或放样的位置与吸收峰的位置基本重叠，因此每一个谱峰的贡献者是谁可以利用吸收光谱的知识来寻找。其次是肽键上与碳原子有关的共价键的吸收光谱带在红外区，或在低于180nm的超远紫外区。在可见波长或紫外区它与碳原子相关的价电子不表现出任何吸收带，因此也没有它的CD带。这样，残基除非有生色团的侧链，不然就不提供CD谱。可以看出ORD的缺点在CD谱中就可以避免。

第八十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四多聚氨基酸从化学上讲比蛋白质简单，只含一种或几种氨基酸，因此研究它们的构象比较容易。许多人曾详细地用其它方法（如红外等）研究过它们的构象，了解到在何种条件下，它们以哪一种构象存在，因此，蛋白质的CD谱可以以多聚氨基酸为模型化合物来着手研究。第八十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四用许多其它方法证明，多聚-L-赖氨酸（PLL）在pH不同时有不同的构象。在水溶液中。pH11，室温时，它是螺旋；pH11，52C加热15分钟后即转变成折叠；而在pH5.7时，它是无规卷曲。Greenfield与Fasman利用这一特点测定了PLL在不同构象状态下的CD谱，其结果如下图。

第八十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第八十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四对于螺旋讲，它的曲线与

PMLG、PLA等相同，也是双负峰。Holzwarth等人证明，谷氨酸、赖氨酸与丙氨酸的共聚物在螺旋时也是呈相同曲线。此后Beychok测定的多聚氨基酸的CD曲线也相同。因此认为，远紫外双负峰是螺旋的典型谱形。

Gratzer与Cowburn总结了1969年前的工作指出，222-223nm间的负峰是肽链处于螺旋时肽键n-*跃迁所贡献。但是极值处[]的数值在不同的实验室利用不同的多聚氨基酸，大约有10％的差别。

第八十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四208-209nm的负峰也是螺旋肽键的*跃迁所贡献，各家的数据可以有25％的波动。对于191nm讲，它也是螺旋的肽键*跃迁的贡献，比椭圆值间可以有30％的波动。事实上，数值间的这种差别是不算大的，结果相当满意。

第八十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四PLL于折叠时给出的曲线是在215nm处的负峰。。在中性pH时的SDS溶液中，PLL也呈现折叠。此时它的CD谱在218nm有负峰，但[]218相应变小。许多工作者也发现，结构的CD谱与溶剂有较密切的关系，因此相应地看，折叠的椭圆值不如螺旋者那样恒定。但是从谱线形状看，图6－3曲线2是典型的。基于这种种实验基础，一般都认为，该曲线反映了多聚氨基酸的折叠结构。

第八十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四无规卷曲时PLL给出的曲线是198nm的负峰,在220nm附近一个小而平宽的正峰。这种峰形是否能典型地代表无规卷曲，看法有些混乱。Tiffany及Krimm（1969）发现Na-PLGA（多聚-L-谷氨酸钠）在水溶液中给出正峰，但在3摩尔／升胍中该峰消失，变成了218-220nm处的负肩，见下图。

第八十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第八十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Dearborn与Wetlaufer测定摩尔／升胍（PH6.0）中PLL的CD谱，发现它的谱形与在0.01摩尔／升NaCl中的一样，也是无规卷曲状。Fasman等人研究了Na-PLGA和PLL做成干膜时的圆二色谱。他们（1970）发现，在200-205nm有一负峰，同时在215-310nm间有一负的肩。此外，Wetlaufer等及Fasman等都发现，一些变性蛋白质的谱形与PLL在溶液中的谱形不完全一样。总的来看，这些变性蛋白质的结果与PLL的曲线有两点区别：一是负峰位置不正在198nm，而经常有红移，峰值也小得多。二是220nm附近正的小而平宽的峰消失，代之以负的峰，这些结果如下图所示。综观这些曲线，可以认为：200nm附近的负峰是无规卷曲的特征曲线。

第九十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第九十一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四6.4.2.2用蛋白质远紫外圆二色谱单值法计算螺旋含量

从多聚氨基酸的研究得出了肽链在三种构象时的典型曲线。从蛋白质的CD谱看也有类似曲线。例如，肌红蛋白，胰岛素，溶菌酶等都给出类似于螺旋的曲线。免疫球蛋白的CD谱类似于多聚氨基酸折叠的谱形。因此可以设想不仅可以用多聚氨基酸为模型定性地研究蛋白质分子主要包含了什么构象，还可能定量地研究蛋白质分子中各种构象的含量。

第九十二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四螺旋给出208nm与222nm两个负峰。可是当初仪器水平要测准208nm处的[]是比较困难的，因此Fasman等人提出用[]222来计算蛋白质螺旋度的方法。他们假设PLL的参考值可以应用于蛋白质，并且认为折叠可以忽略不计，于是列出下列公式

第九十三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四随着仪器的发展，紫外CD谱可以测准到185nm。此时Greenfield和Fasman发现，对于PLL讲，折叠与无规卷曲两种构象状态的CD谱相交在208nm。在交点上其平均椭圆值[]208＝－4000度·厘米2·分摩尔－1。在螺旋态时，=-32.600+4000度·厘米2·分摩尔－1。因此建议改用下列公式来计算螺旋的含量:

第九十四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四[练习题]某蛋白质浓度为0.05mg/ml,光径为10mm,测得208nm处的椭圆度值θ208的测量值为－102m°(毫度)，试计算208nm处的平均残基椭圆度值和该蛋白质中α螺旋的含量。第九十五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Fasman等人还提出了折叠含量的计算方法。其原则是根据[]208计算出螺旋，然后假设不同的折叠的含量X，并令XH＋X＋

XR=1其中XR是无规卷曲的含量。于是认为各不同波长时的[]

是各构象组分的贡献的加和。利用计算机算出各波长的[]，得出计算曲线。假设一些不同的X值，分别求出它们相应的计算曲线，找出与实验曲线最接近的曲线。相应于该最接近曲线的X及XR即认为是该蛋白质的相应结构的含量。此法被Fasman称为方法I。第九十六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第九十七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第九十八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第九十九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第一百页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四为了改进计算精度，他们还利用计算机将公式及从方法I得到的X及XR的数值反复修正，使最后的拟合曲线与实验曲线之差变得最小，于是得到更为可靠的XH、X，及XR值。这种修正的方法被Fasman等称为方法II，其结果与X射线晶体结构的结果比较，螺旋含量高的蛋白质数据比较好；对于螺旋含量低，结构含量较高的蛋白质，数据不够理想。

第一百零一页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四6.4.2.3用远紫外圆二色谱计算蛋白质的构象含量

Fasman等人的计算方法虽然结果比较满意，但是他所用的单一构象的参考数值及曲线来自多聚氨基酸。蛋白质是包括了多种氨基酸的、有特定顺序（即一级结构）的大分子，二者结构不同，因此Fasman所使用的参考数值能否用于蛋白质是一个疑问。如前述，以变性蛋白质的CD谱与PLL无规卷曲的CD谱比，两者有相当的不同，因此提出了解出蛋白质的参考曲线问题。第一百零二页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Saxena与Wetlaufer提出可以利用已解出晶体结构的蛋白质，算出它们的含量，然后测定这些蛋白质的远紫外CD谱，在这一基础上解出蛋白质在三种构象状态下的参考曲线。第一百零三页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四首先他们假设，每一波长的椭圆值是三种构象在该波长的贡献的加和，即

同时服从方程XH＋X＋

XR=1，［］H,、［］,及［］R,各是蛋白质的残基全部处于相应的构象时在该波长的椭圆值。XH、X，及XR值可以由晶体结构解出。由于该方程式有三组未知数，即［］H,、［］,及［］R,。因此只要有三个蛋白质，即可解出这三根参考曲线。

第一百零四页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Wedlaufer等用肌红蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶三个蛋白质的实验结果，算出了三根参考曲线，如下图中所示。图中同时列出了Fasman从PLL来的相应曲线。两组曲线相比，颇为相似。在蛋白质中，a螺旋的双负峰的位置也是222nm及208nm，但蛋白质的[]222

比PLL的[]222

更负；从折叠看，蛋白质的CD与PLL比较有显著不同，即负峰移到220nm，但195nm的正峰与螺旋相似；对于无规卷曲讲，差异更显著,蛋白质的负峰移至192—193nm处，其[]只有PLL的三分之二，在222nm处出现正峰，[]222

相当于PLL的四倍。

第一百零五页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四第一百零六页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四和Wetlaufer等人差不多同时，Chen与Yang提出了相类似的方法。他们假设，一个蛋白质分子内由三种构象成分组成，即螺旋，折叠和无规卷曲，并服从式XH＋X＋

XR=1假设。然后进一步假设，各个波长的［］值由上述三种构象所共同组成，并且是它们的代数和，即有下列关系：

其中，［］H,、［］,及［］R,各是蛋白质在全部残基都是螺旋，折叠及无规卷曲时波长是时的［］值。

第一百零七页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四根据一些多聚氨基酸的远紫外CD谱，他们假设，各种蛋白质当残基全部处于螺旋，或折叠，或无规卷曲时，相应的谱线都是相同的，即），［］H,、［］,及［］R,

三根谱线能够适用于所有的蛋白质。这样，可以设法找到蛋白质的三种构象的标准参考曲线。第一百零八页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四有了这些前提，他们就采用了与Wetlaufer相同的方法，即找到一些蛋白质，它们的晶体结构已经解出，它们的远紫外CD谱也已测定。对于这些蛋白质讲，可以从晶体结构中算出XH,i,X,i及XR,i，此处i表示第i个蛋白质。还假设蛋白质在晶态时的构象与溶液态时的构象是一样的。这一假设从许多实验结果看，可以说近似地成立。第一百零九页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四这样应该有

其中，在上式中，［］,i从圆二色仪中测出，［］H,、［］,及［］R,

是未知的三根曲线。只要有三个蛋白质的［］,i及Xi参数已知，就可解出这三根参考曲线。

第一百一十页，共一百二十五页，编辑于2023年，星期四Chen与Yang考虑到具体蛋白质的复杂性，就选用了五个蛋白质：肌红蛋白（鲸），溶菌酶（蛋清），乳酸脱氢酶（狗鱼），木瓜酶（木瓜汁）及核糖核酸酶（牛胰）。五个方程式解出三个未知数，可能会顾此失彼，数据有些不好凑。还要计算整个远紫外区（190—250urn）的几十个波长的数据。因此他们利用最小二乘法找出了三根参考曲线。Chen与Yang考虑，如能用更多的蛋白质来解这三根参考曲线，可能结果更好。于是选出了十二个蛋白质，重新计算了蛋白质的参考曲线，发现曲线形状基本上与从五