奶粉中蛋白质含量实验方法

1【摘要】

目的尝试建立一种快速准确地测定奶粉中蛋白质含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白质后，运用BCA〔二喹啉甲酸〕法，在570nm波长处，分别测定标准蛋白质应用液与样品稀释液的吸光度值，基于测定液中蛋白质含量与其吸光度值呈正比关系，计算出样品中蛋白质的含量。结果待测溶液中蛋白质浓度在0～250μg/ml范围内标准曲线呈线性关系，其回归方程为：2，相关系数r=0.998，平均回收率为100.2%。结论结合三氯乙酸沉淀的BCA法适用于奶粉中蛋白质的快速检验和掺伪检验。【关键词】

奶粉；蛋白质；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺Arapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilk

ZhangZhiqiao,ShenGuodong,WangGang

FirstMiddleSchoolofHefei,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001

［Abstract］Objective

Toexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen-containingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination.Methods

Conjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid,BCA(bicinchoninicacid)methodwasused.Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance,proteincontentwascalculatedinpowderedmilk.Results

Proteincontentinmilksolutionshowedagoodlinearrelationshipatthedetectionrangesof0-250μg/ml,withregressionequation:Y=301.12X-73.42andrelatedcoefficient:0.998,andtheaveragerecoveryratewas100.2%.Conclusion

BCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowderedmilk.

［Keywords］Powderedmilk;Protein;BCAmethod;Trichloroaceticacid;Melamine

蛋白质是人类最重要的营养物质之一。因此，蛋白质含量一直是食品检测中的重要指标。目前蛋白质定量方法较多,如凯氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。虽然凯氏定氮法目前是测定蛋白质含量的国家标准方法，但其操作繁琐费时，且蛋白质含量是通过测定氮的含量推算得来的，容易被其他含氮物质干扰〔如2021年9月“问题奶粉〞的出现源于有人利用凯氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白质含量虚高〕；Lowry法和紫外分光光度法存在显色所需时间长，灵敏度低，稳定性差等缺点［1］。为弥补这些缺乏，本实验利用BCA〔二喹啉甲酸〕法结合三氯乙酸沉淀法建立一种快速简便的测定奶粉中蛋白质含量的方法。

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摘要：牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中局部成分含量。

关键字：牛奶

蛋白质钙铁锌

1、实验目的

用分光光度法测某牛奶中蛋白质、钙、铁、锌的含量。

2、实验原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反响生成紫红色化合物，称为双缩脲反响，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反响产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反响外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反响。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活泼的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育缓慢，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以参加少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

当一束光通过一个吸光物质〔通常为溶液〕时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。

吸光度用A表示。

A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度〔通常为比色皿的厚度〕，单位cm，c为溶液浓度，单位g/L

影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。

符号A，表示物质对光的吸收程度。

邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量Fe2+的高灵敏度显色剂在pH2～9的条件下，Fe2+与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在510nm波长处有最大吸收。

测定时，控制溶液的酸度在pH＝5左右较为适宜。酸度高时，反响进行较慢；酸度太低，那么Fe2+离子水解，影响显色。当铁浓度在5.0mg／mL以内时，吸光度与Fe2+浓度呈直线关系。Bi3+、Cd3+、Hg9+、Ag+、Zn2+等离子在pH＝2~9时与邻二氮菲生成沉淀。Co2+，Ni2+，Cu2+等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。

锌是人体中必需的微量元素之一，锌缺乏会阻碍生长发育，过量又会导致胃癌等疾病。人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。在pH4.0～5.5的水溶液中，锌离子与双硫腙〔C13H12N4S〕生成红色螯合物，摩尔吸光系数535=9.3×104L·mol-1·cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。在选定的pH条件下，用足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。

3、实验步骤

3.1、试剂的配制

3.11、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:

先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸钠固体6.5461g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。

3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：取25ml95％乙醇与25ml无水乙醚混合

3.13、双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O0.3g，酒石酸钾0.9g和碘化钾0.5g，分别溶解后混匀，加6mol·L-1NaOH10mL，最后加水至100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

3.14、蛋白质标准液(10mg·mL-1)，用小烧杯称取枯燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。〔如假设不能溶解，滴加几滴6mol/LNaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容〕

3.15、铁标准溶液(40.0µg·mL-1)：:准确称取0.0345g硫酸铁铵〔NH4Fe(SO4)2·12H2O〕于烧杯参加6mL6mol·L-1HCl和少量水，溶解后用纯水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0µg铁。

3.16、盐酸羟胺溶液(100g·L-1)：:称取10g盐酸羟胺(NH2OH·HCl)，溶于水，并稀释至100m〔新鲜配制，两周内有效〕

3.17、邻二氮菲溶液(2g·L-1):：称取0.20g邻二氮菲(C12H8N2·H2O)，溶解于加有2滴浓盐酸的纯水，并稀释至100mL〔新鲜配制，两周内有效〕

3.18、醋酸钠溶液〔1.0mol·L-1〕：:称取8.2030g醋酸钠，用纯水溶解后稀释至100mL。

3.19、锌标准溶液〔1.00µg·mL-1〕：准确称取0.0100g基准锌于100mL烧杯中，参加6mol·L-1HCl0.5mL，立即盖上外表皿，待锌完全溶解后，以少量水冲洗外表皿及烧杯壁，将溶液转入100mL容量瓶中，定容，即为锌标准贮备溶液。准确移取1mL锌标准贮备溶液，稀释定容至100.0mL，即得1.00µg·mL-1锌标准溶液。

3.20、0.1％双硫酸腙四氯化碳贮备溶液：称取0.10g双硫腙〔C18H12N4S〕，在枯燥的烧杯中用四氯化碳溶解后稀释至100mL，倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱内保存，可稳定数周。

3.21、双硫腙四氯化碳溶液：临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳贮备溶液，用四氯化碳稀释约30倍，至吸光度为0.4〔波长535nm，1cm比色皿〕。

3.22、25％硫代硫酸钠溶液：称取64.60g硫代硫酸钠〔Na2S203·5H20)，溶于100mL纯水中。

3.23、1＋1氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀释

3.2、牛奶中酪蛋白的提取

3.21、酪蛋白的粗提

50mL鲜牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢参加预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液50mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟〔3000r·min-1〕。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的纯化

用水洗涤沉淀3次，离心10分钟〔3000r·min-1〕，弃去上清液。在沉淀中参加30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在外表皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3.3、酪蛋白含量的测定

3.31、标准曲线的绘制与样品的测定

取试管8支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。

3.32、计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

3.4钙含量的测定

3.41、钙制剂钙含量的测定

准确移取25ml的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，参加三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH4mL，参加水20mL，摇匀，加铬蓝黑R8~10滴，用0.01mol·L-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量〔g/100mL〕，并与包装上注明的含量作比拟。

3.42、考前须知

量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01mol·L-1EDTA体积为20~30mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

3.5铁含量的测定

3.51、标准曲线的绘制

取25mL比色管6支，按下表顺序配制铁标准系列并记录测量的数据〔注意：参加盐酸钱干后需摇匀放置2min捉，再侨进行颗下一铁步操堆作〕瞒，加树完试唤剂后瞎摇匀寿，放剑置徐37疏℃邻水浴扁中保氧温炸15茧mi辫n丢，以持空白颠液为坑参比全，在奸51棋0n那m疤下测哈定各豪溶液例的吸昨光度很值。

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