肉牛冲胚方案

天物份司 案肉牛冲胚方案1供体选择和超数排卵1.1供体牛的选择1.1.1供体牛要求健康状况良好体况中等以上生殖系统和繁殖功能正常，无遗传和传染性疾病。1.1.2青年母牛应在14个月龄以上或达到成年牛体重70以(300~350kg。1.1.3满。4和。2理素ADE量。2法诱导卵泡波同步发生方法进行超数排卵处理，即在发情周期的任意一天放入含孕激素的阴道栓，放置阴道栓4d后(放阴道栓当天为0d，开始连续4d肌肉注射FS（~0g天2隔12h。射FSH后48h肌肉注射PG0.4mg/头·次，再间隔12h撤栓。注射PG后48h观察发情和人工授精（不同FSH用和厂批号的FSH时，应作超排效果预试验。）3供体牛的人工授精发情后12h进行第一次输精每间隔12h再输精一次每次一支细管精液，共输精2~3次。4胚胎采集（采卵）及处理4.1胚胎采集时间供体发情后第7d（发情当天为0d）采集胚胎。4.2胚胎采集4.2.1麻醉将供体牛前高后低站立保定后掏净直肠内的宿粪可采用2普鲁卡因在荐椎和第一尾椎间隙注射4ml~5m实施硬膜外腔麻醉其它麻醉剂按说明书使用。1天物份司 案4.2.2外阴清洗、消毒麻醉后将牛尾栓系在牛体一侧用清水冲洗会阴部和外阴周围再用0.1%新洁尔灭或0.1高锰酸钾冲洗消毒用灭菌纸巾擦干最后用酒精棉球擦拭消毒外阴部。4.2.3吸除子宫颈粘液用粘液吸除器吸除子宫颈粘液对青年母牛或子宫颈通过困难的供体牛可先用子宫颈扩张棒扩张子宫颈，再吸除子宫颈粘液。4.2.4采胚通过直肠把握将带有钢芯的冲胚管经过子宫颈轻轻地插入一侧子宫角大弯根气8l固至 7。采时采吊在阴部10m（Y采，入0l量0l。冲完侧子角后钢芯插入胚管并气，心固钢芯，把采胚退到宫体转向入另侧子角，复上述作。4.25采胚后处理素0万U和链霉素100万U或1%液0l射PG04在胚2d射0.4mgP。4.3检胚4.3.1回收液处理4.3..1集卵杯法用20G针头的注射吸20ml冲胚液从上下冲洗集卵杯内侧的龙网4，清杯中泡沫镜检。4..12过滤法：胚时去回液，后将中留的20l回收液入平，再少量卵液洗过杯2次一并入平镜检。4..2镜检将回冲胚的平在10倍体视微镜，上到、从到右或从外内Z径00m将到的胎移培养皿中保存小中，后将一体母的胚从滴中部出移新液胎3至0量。3类2天物份司 案胚胎发育阶段分类应符合表1要求。表1胚胎发育阶段和形态特征胚胎发育阶段 形态特征（ya，含有6个细胞以上，卵球紧界限晰，没有形EM）致密桑椹胚（Compctedmorul，CM）早期囊（Earylasocst，E）

成致密细团。卵裂进步裂小缩团状看清卵裂球限细团据带的60%7%空间。细胞中现在囊细团据明内的70~0%空。已经化滋层内密、色暗内细囊胚（Blsoyst，BL）

胞团囊腔显主征滋层内胞团的形比容区。的胎胞满个透明带。扩张胚（Epaddbatcst，EXB）

整个胎直增大囊胚充分张，透明之间无隙，明带薄，约是来厚的1/3。孵化囊胚（Hatchig正处于孵化阶段的胚胎透明带破裂或胚胎细胞团blsoyt，H） 正在脱出或者已脱离透明带。4.3.4胚胎发育日龄标准胚胎发育日龄标准应符合2要求。表2胚胎发育日龄标准段龄段龄胞d胚d-胞d胚d-胞d囊胚d-胞d胚d-胞 d 胚 d胚d4.3.5胚胎质量形态学鉴定及分级胚胎质量形态学鉴定及分级应符合3的要求。表3胚胎形态学鉴定及分级等级 特 征胚胎发育阶段与胚龄一致透明带光滑无缺陷胚胎细胞团形态完整轮A级或于%。，裂B级球大小基本一致，色泽和细胞透明度良好，变性及游离细胞约占%。C级变3天物份司 案暗，卵裂球较松散游离，变性及游离细胞约占30%~50。可用作鲜胚移植。D级未受精卵，或发育停滞变性、卵裂球不规则、少而散级不可用。4.4胚胎洗涤4.4.1胚胎应用无菌的保存液洗涤5次，每次洗涤不少于200μl。4.4.2每组清洗胚胎数不能超过10枚。4.4.3每次清洗应更换无菌吸管。4.4.4每次清洗胚胎带入平皿中的液体量不能超过1%。4.5胚胎冷冻保存与解冻4.5.1乙二醇冷冻胚胎直接移植法程序4.5.1.1将胚胎放入1.5mL或18mol/L乙二醇冷冻保护液中，平衡0min，迅速装入0.25ml细管。装管顺序：乙二醇液，气泡，含有胚胎的乙二醇液，气泡，乙二醇液，封口。每支细管可装1枚或1枚以上胚胎。见下图：棉塞 乙二醇液 乙二醇液+胚胎 乙二醇液封口处标签管气泡 气泡4.5.1.标记装管后，采用聚乙烯醇粉或封口机封口，或用标签塞插入封口端，标记内容：生产单位（代号）标记品种和供体牛号及种公牛号，胚胎发育阶段、等级及数量、胚胎生产时间等，乙二醇冷冻的胚胎应标记直接T。4.3植胚入-6℃或-7℃冷冻仪平衡5min后，用经过液氮冷却后的镊子夹住塑料细管封口端（远离胚胎端）植冰。4.5.1.4冷冻：植冰后，平衡10min，以0.3℃/min~0.5℃/min速降温到-32℃~-35℃时，平衡10min，把细管投入液氮中。4.5.2解冻：从液氮罐中取出细管，空气中停留5s，投入32℃水浴中，待，。4天物份司 案附录A试剂与药品需液A.1素。A..20.1%新洁尔。A.1.3生。A.1..4促卵泡素（H。A.1.5前P。A.2液A.21碘酊。A..201%。A.2.3生。A.2.42%。A.2.5。A.2.6。附录B 设备与耗材B.1材.15m、、、50m性射及。B..2。B..3CID放器。B..4用。B.2集材B..1用。B..2可延伸采胚。B..3用。B..4用。B.2.524”。B..6。B..7。B82l注器。B.90器。B.05器。1杯。B.2.2径1培养皿。B.2.3。.41ml容量。B.2.5封，%酒精棉。B.3材5天物份司 案B..1体视显微镜X。B..2。B..3径培养皿。B..4。B..5。B360.5塑细管。B..70.2µ。B..8细。B..9。B.3.0标签。附录C 器具的洗涤与消毒C.1具涤C..1涤C.1..1浸泡用5%稀溶浸泡1h以。C.1..2和如高级洗衣粉或洗洁精）洗刷，洗刷时涤（20~）n中洗。C.1..3间应于h。C.1..4，用，蒸水洗(～)。C..2洗C.1.2.1C.1.2.2

。H沸1n～n%盐酸浸泡30n来和各清洗2～。C..3洗器过物，集应冲干，干。C.2器具毒.1毒6天物份司 案C.2.1.1、培养板等）。C.2..2培面5灯，使每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，容器内侧向上，塑料吸管需垂直置于紫外灯下照射n。C..2菌及后0理1h~1.5h在度至0。C..3菌属高、液体石蜡油等。上述物品经包装放入高压灭菌器内，在12℃（0.105MPa）高压灭菌in。C..4过毒胚胎培用0.22µmPBS用0.45µm滤膜过，过滤的23。C..5毒聚乙烯冲胚管以及乳胶管等可在7液毒n冲用液。附录D 放置阴道栓方法D.1准备作D.1.1用C器放CIR。D.1.2。D.1.3。D.2操作D.2.10.1液。D.2.2CIIR两角水平。D.2.3置R时一定要注意不要造。7天物份司 案附录E供体牛超排、采卵及胚胎冷冻记录表供体牛超排、采卵及胚胎冷冻记录表如表E。表E 表及：牛号 期 品种 量间 胎次 间超排处理程序日/月 备 注 ＡＭ AM AM 药物厂家 批 号撤栓 处理人员：发情时间：输精时间 一次 二次 三次 种公牛号 输精者采胚 操作者：采胚日期年月日 时直检结果采胚 获卵总数 合计 A级可用胚胎B级 C级 合计

不可用卵未受精 变性结果鲜胚移植胚胎冷冻 冷冻数量冷冻仪

贮存罐号：提桶号：保存液：型号 冷冻液：上机运行 植冰温度： 间： 结：年月 日 时 分至时分记字 备：8天物份司 案附录F胚胎生产和移植费用结构分解1、每头供体牛使用费为2100元。主要费是因超处理耽误70天配种时间，70天饲养为2100元（每天30元。2、超排理药品用每头为950元。主要用于进口CID，每头100元；进口促卵泡素FH每头800元；产前烯（PG，每头为10元；精液费为40元4支每支10元。3、实验室仪器及耗材费用，每头1796元，详见下表：100头牛只胚胎生产仪器及耗材情况表序号 项目 数量1胚胎冷冻仪12 双目显微镜 1

单价97,000.0046,000.00

总价97,000.0046,000.003 母牛用3路胚胎采集直径6,长580mm) 1 5,734.00 5,734.004 2m软管–用于直径6mm的采胚器(per5) 545.0025.005 可延伸采胚管，有黑色刻度，直径6mm0920020.006

青年母牛用2路胚胎采集器(直径4mm,长510mm)

1 5,800.00 5,800.007 青年母牛采胚性气球(pr)8 气球钳

5 150.001 1,800.00

750.001,800.009 青年母牛用2路采胚管1，CH2，5cc 1 280.00 280.0010 24”采胚管钢芯CH18或CH20 1 269.00 269.001 CH18或H20采胚器软管，含过滤器 1 460.00 460.0012 超薄胚胎移植手套1X1per20boxesf100)13 宫颈扩张器

100 1502 1,980.00

150.003,960.0014 URFLSH采胚液1升(per4) 4 155.00 620.0015 胚胎保存液20ml(per4)16 乙二醇胚胎冷冻稀释剂20ml

4 85.0 340.004 93.0 372.0017 用于胚胎移植采胚器的Z器18 杯形过滤器19 50个过滤器，0.22μ，用于稀释液过滤20 胚胎移植滗析器

5 265.002 380.0012,780.001 1,950.00

1,325.00760.002,780.001,950.0021 6孔培养皿(0个) 0 49.0 490.0022 PETRI培养皿100x10020个) 0 18.0 360.0023 黄色直接输胚管0,25l带DT标识(