基因工程实验设计

基因工程实验设计LT基因工程实验设计DNA重组分子的构建及筛选检测实验原理：Bt蛋白中的〃Bt〃是苏云金芽抱杆菌"Bacillusthuringiensis〃的缩写。〃毒蛋白〃是其产生的一种伴胞晶体，有时也称为〃deIta-endotoxin”,即学术刊物中中文所对应“delta内毒素”。"毒”是指其对特定的物种有毒性，并非对所有的生物体都有毒性。而且不同的Bt菌系产生的毒蛋白的特异性也不同。Cryl4-4是从苏云金芽勉杆菌中获得的一中新的杀虫晶体蛋白样基因,对棉铃幼虫有较强的杀虫活性。实验步骤目的基因的获得1.在NCBI网站上查找目的基因的核心序列1atgtatatggctgaaattaaacgtttagattattatttaggtgccttgccttttggtaatttttatgtagatgattgtgatactttaaaaaattttatagatagccttttagatggtaaaccttctacaa61121181241actatcttagtatttttcta301361421481gtacaaacaagctgaagtaagcagaaatttcaaaaattaatgaataatacatgatttagaatgatacaagcagttagtacaaggaagtgtctggacaatattattccttctcctctaacattccatagcatactgaaaaaaactgttaccaagtattccttaatttttctggtaatgtaaaccctaacccacttatcaaa541601661721781841901caaattatgttcaggaacagttatatgatgacaggtttagactggttcaatcttcccaagatacgacatctagcaaaaattacatcgggaaagtaaggtctattaaataattactgcattaaaatataaggttttccttctcagtccggttaatattccatccaatccct1atgtatatggctgaaattaaacgtttagattattatttaggtgccttgccttttggtaatttttatgtagatgattgtgatactttaaaaaattttatagatagccttttagatggtaaaccttctacaa61121181241actatcttagtatttttcta301361421481gtacaaacaagctgaagtaagcagaaatttcaaaaattaatgaataatacatgatttagaatgatacaagcagttagtacaaggaagtgtctggacaatattattccttctcctctaacattccatagcatactgaaaaaaactgttaccaagtattccttaatttttctggtaatgtaaaccctaacccacttatcaaa541601661721781841901caaattatgttcaggaacagttatatgatgacaggtttagactggttcaatcttcccaagatacgacatctagcaaaaattacatcgggaaagtaaggtctattaaataattactgcattaaaatataaggttttccttctcagtccggttaatattccatccaatcccttctagaaaatcgctaatcaataatttttatatggtactcaaaattcttctcatggattccttcgttgcagtcagcagataaacattcgaccaaacagcagagtagtgtaaaattgttcaaagtgtagattgtaaaaattaatagaaccaagtgaatacttatgttacaaatcaaagtgttcagaatatgtatatgataatccttatcttttgagaaagataaattggagggaaacttggaatggtggggttactgtaagtcagaaacaacaacaacttctctggttatacaacaagggttttcatttttctggttctatgtaggtttggtagactacgatattcaacagtaggtagagattttcaggaagtggattttttctgaatatccaattaataataagtattaaatcaatcaattgtaattgctaa2.根据所查序列运用primer5.0进行引物设计3.确定适合引物的序列及位置，设计酶切位点及加保护碱基上游引物：5,CCCCGGGATGTATATGGCTGAAA3,Smal下游引物：5,CGAGCTCTTAGCAATTACAAGTACC3,Sacl所选限制性内切酶酶切序列及酶切点:Sma1:CCC]GGGSac1:GAGCTiC4.菌体培养：将获得的苏云金芽抱杆菌于YT液体培养基，于30°C振荡培养过夜，获得足够的菌体。收集菌体（注意吸干多余的水分）。辅助裂解：如果是G+菌，应先加溶菌酶100ug/mL50uL。37C处理1h。运用CTAB法提取DNA。将提取的DNA用PCR扩增获得目的片段。二.构建克隆载体质粒（pEASY-Tl质粒）连接T载体，转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan和Amp）,37C培养12-16小时后，菌检（M13引物）。附图：质粒pEASY-T1图谱UcZ原理：很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pEASY-T1载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pEASY-Tl载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pEASY-Tl载体中，形成含有目的片断的重组载体。反应体系：T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液10xbuffer，无菌ddWater2.从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12-16h后，提取质粒，送去检测。三表达载体的构建（pBI121质粒）附图：pBI121质粒图谱

(H.662)NOU(14410)PasI(10.475)NdelBspDI-Clal(4537)(12..671)BsEKTSHI(LD.7D0)PflMI*PspOMl(3B99}ApalM(H.662)NOU(14410)PasI(10.475)NdelBspDI-Clal(4537)(12..671)BsEKTSHI(LD.7D0)PflMI*PspOMl(3B99}ApalM知3)(9695)FspAI(9D97)SanDI(9DOT)BbwCI昭53)AhdE(B29D)DrainS79H2]EcoRI(13.DDL}BstElIEcoNI(1627)SnaBI：(6229;>(7715)SaclEcoSlkl(770)Pinel-；2492)Bsu36I(Z70D)Nhel(27L5)Bmtl(2739)Hindlll(WO)(4966>Bsal(50』5)Seal(5179}XbalBamHI(Sail)TspMI-Kmal(5826)Smal(功2£J酶切体系：30°CTangoTMbuffer1XSmalSacl将目的片段确定正确的T质粒酶切，跑胶，切胶回收，获得带酶切位点的的目的片段，目的载体PBI121也进行酶切，跑胶，切胶回收。将酶切片段和酶切后的载体连接。四.目的基因的检测与筛选将表达载体运用CaCl2法转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan），12-16h后，菌落PCR（所设计的引物）。从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12-16h后，提取质粒。进行酶切验证。将酶切验证结果正确的菌落的质粒转化农杆菌，涂