基因工程总结

第一章绪论1、 基因工程的含义：按照人们的意愿，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的新的生物类型。2、 基因工程的优点：打破物种间基因交流的隔离界限；②克服常规育种的周期长，效率低的缺点，定向改造生物性状；③可按照人的意愿去改造物种。3、 基因工程理论依据：不同基因具有相同的物质基础；②基因是可分割的；③基因是可以转移的；④多肽与基因之间存在对应关系；⑤遗传密码是通用的；⑥基因可以通过复制传递给下一代。注：基因工程及其应用的图解看看第二章DNA重组的相关技术及原理1、 重组DNA技术的原理重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序2、 碱性SDS法提取质粒DNA原理：强碱使所有DNA变性沉淀，而pH为中性时，质粒DNA复性快，形成闭合环状从沉淀物中分离。3、 提取DNA总的原则保证核酸一级结构的完整性；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。4、 核酸鉴定①浓度鉴定②纯度鉴定③完整性鉴定5、 限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核昔酸序列（4-8bp），并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。6、 限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌 （Escherichiacol）Eco流感嗜血菌（HaemophilusinfluenzaeHin用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoR）。如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制性内切酶，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRVo属名种名株名HaemophilusinfluenzaeD 嗜血流感杆菌D株 HindIIIEcoRI——EscherichiacoliRIHindlll—HaemophilusinfluensaedIIISacI(II)一StreptomycesachromagenesI(II)7、 限制性核酸内切酶的作用机制以环状和线形的双链DNA为底物，在适合的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3'—OH基团和5'—P基团的片段。8、 同裂酶：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindI和HsuI。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。9、 同尾酶:识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglII、BclI、Xholl等10、 酶活性单位(U):在最适反应条件下，一个DNA分子上含有一个酶切位点，60min内切割1?g人DNA所需的酶量称为一个单位。旦送号0活性：如果改变反应条件就会影响酶的识别位点专一性和切割效率，称为星号(*)活性。12、基因工程的其他酶DNA连接酶:DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5’-磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。；DNA聚合酶(Klenowfragment)性质①5'?3'聚合酶活性。②3'?5'外切酶活性。(失去了5'?3'外切酶活性)用途①3'端补平②DNA的3'末端标记，在3'隐蔽端加上标记的dNTP。③cDNA第二链的合成④双脱氧末端终止法测定DNA序列（3）核酸酶S1催化反应类型：ss-DNA;ss-RNA;双螺旋变性区13、 聚合酶链式反应PCR:PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：（1） 作为模板的DNA序列；（2） 与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；（3） TaqDNA聚合酶；（4） dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。14、 PCR技术的原理（1）DNA模板变性（2）DNA模板与引物复性（3）DNA链的延伸15、 PCR的过程第一步预变性（pre-denature）90-95°C下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。第二步变性（denature）双链完全变性成单链第三步复性（anneal）37-60°C下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高②引物的链短。第四步延伸（extend）72°C下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核昔酸。第五步 变性进入循环重复94°C下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。16、 PCR扩增特异性DNA片段的主要条件（1）TaqDNA聚合酶（2）引物（primer） （4）模板（template）（5）dNTPs（6）Mg2+的浓度17、 PCR的特点（1）特异性强 （2）敏感性高（3）快速 （4）简便 （5）可以扩增mRNA18、 电泳的基本原理DNA在中性或偏碱性的缓冲液中带负电，在电泳过程中处于凝胶靠负极端的DNA通过凝胶分子筛向正极端移动。19、 电泳迁移率：与DNA分子的构型和大小有关与DNA分子中的碱基组成和顺序无关DNA分子的构象（型）：1型：超螺旋环状 II型：带切口环状III型：线状相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快；线性分子次之；伸展开环状最慢20、 影响连接反应的因素（1）插入片段与载体的浓度比例 （10~20倍增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。）（2） 反应温度（一般14~16°C）（3）反应缓冲液第三章基因的克隆载体1、 载体：在基因工程操作中，携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞，并在其中得以无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。2、 按功能划分：克隆载体（cloningvector）:使目的片段能在细菌细胞中复制的载体。表达载体（expressionvector）:使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。3、 基因克隆载体的必备条件：多克隆位点；②能自我复制，有一个复制起点；③选择性标记；④安全。4、 标记基因的作用：①指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞；②指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。这种指示也可以是选择性的，也可以是非选择性的，绝大多数为后者。5、 质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。6、 质粒的空间构型：①共价闭合环状DNA（cccDNA）；②开环DNA（ocDNA）；③线形DNA（lDNA）7、 质粒空间构型与电泳速率:scDNA最快、LDNA次之、ocDNA最慢。8、 质粒的不亲和性（不相容性）：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不亲和性或不相容性，这两种质粒称为不亲和性质粒，组成不亲和性群；而彼此能够共存于一个细胞中称为亲和性质粒，亲和质粒则属于不同的不亲和群。9、 天然质粒的局限性：分子量大，拷贝数低；②筛选标记不理想；③单一酶切位点少或无。10、质粒载体的构建策略：提高质粒载体的拷贝数；②引入多克隆位点MCS；③引入抗性标记基因；④克隆载体DNA分子应尽可能小；⑤在克隆载体中组装“元件气10、 筛选重组子的示意图一一重点11、 ？互补：蓝白斑选择原理：①X-gal:②？-半乳糖昔酶的显色反应；③lacZ的?互补。12、 穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。13、 Ti质粒载体：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒。14、 Ti质粒作为载体的可能性：①能够自发地整合到植物的染色体上;②能转化多种植物;③强启动子一一T-DNA的opine合成酶基因上游有一个强启动子，能启动外源基因的表达。15、 天然Ti质粒作载体的缺点：①分子量太大（200kb）；②限制性酶切位点太多。③被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。④在大肠杆菌中不能复制。16、 Ti质粒的改造：①保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。②减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。③取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。④冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。⑤加入大肠杆菌的ori和选择标记。⑥加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列。17、 Ti载体的类型：①共整合载体一一需要同源重组才能插入外源基因；②双元载体一既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。18、 cos位点：？DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。19、 天然?噬菌体作为载体的局限性：?噬菌体的非必需区太长；②非必需区段上常用的单一限制酶切点少；③选择标记基因少；④载体的安全性20、 ？噬菌体载体的构建：构建策略：①删除?噬菌体的非必需区，在这个非必需区内制造限制酶切点，删除?DNA必需区段上常用的限制酶切点；②在非必需区引进选择标记基因。③建立?DNA重组分子体外包装系统21、 cosmid载体（粘粒）：一类由人工构建的含有1噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cossite—carryingvectors。22、 酵母人工染色体：YAC的特点：（1）只能在酵母细胞中扩增。（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。（3） 构建原理，按染色体结构构建。YAC的组成结构：（1）着丝粒区（Cen）；（2）端粒（Tel）；（3）复制起点（Ori）；（4） 克隆位点；（5）在酵母中的标记基因；（6）在细菌中操作；第四章目的基因的制备1、基因组文库：将某种生物整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和无性扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，也称为基因文库。2、 基因组文库构建的一般步骤：基因组DNA片段的制备；②载体的准备一一相应的酶切，脱磷酸化等处理阻止载体自连；③载体与基因组DNA片段的连接一一粘性末端直接连接；人工接头法；同聚物加尾；④转化细胞和克隆选择。3、 cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库(cDNAlibrary)，也称基因文库(genelibrary)。4、 cDNA文库的特点：以mRNA为材料，是RNA病毒进行基因克隆的唯一途径。不含内含子序列，可以在细菌中直接表达。克隆数比DNA文库小的多，容易筛选。常来自结构基因，包含了所有编码蛋白质的基因，筛选的假阳性率低。结构基因的表达具有器官、代谢阶段特异性，由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，表现不均匀性。5、 不对称PCR(asymmetricPCR)目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是50:1或100:1,关键是限制性引物的绝对量。6、 差别杂交：需要两种不同的细胞群体(目的基因正常表达、目的基因不表达)，分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针平行杂交，对有表达目的基因的总mRNA反转录构建的cDNA文库进行筛选。7、 差别杂交的局限性：①杂交灵敏度低，对于低丰度的mRNA尤为明显；②工作量大，需大量的杂交滤膜和鉴定大量的噬菌斑；③重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。8、 消减杂交：原理：通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建消减文库的方式来分离目的基因。有mRNA消减杂交和基因组消减杂交。前者适合分析两样本中差异表达的基因，后者适合克隆两样本特异性存在的基因。9、 mRNA差异显示PCR(DDRT-PCR):用3’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增(mRNAdifferentialdisplayRT-PCR，DDRT-PCR)，在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000bp之间的DNA条带。10、 染色体步移(chromosomewalking):首先以已知基因或分子标记为探针从基因组文库中筛选与其有共同序列的克隆，再以该克隆为探针从文库中筛选与其有部分重叠序列而且更靠近目的基因的新克隆，同理，再以新克隆为探针依次筛选新克隆，直至所需克隆的目的基因。11、基因芯片技术(genechip)特点：①高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读；②多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差；③微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率；④自动化：降低成本，保证质量。第五章目的基因导入受体细胞1、 DNA体外连接应注意的事项：插入片段与载体的酶切位点互补DNA插入的方向正确插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定位插入载体（2）起始密码防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体2、 大肠杆菌受体细胞的选择重组缺陷型：避免与受体基因组进行同源重组，便于重组DNA独立存在限制缺陷型：避免修饰和降解，使重组DNA稳定存在易于转化或转导：提高细胞的通透性，较高的转化率遗传互补型：有明显的选择性差异，有利于重组体筛选具有较好的翻译后加工，有利于真核基因表达感染缺陷型：防止感染，安全性高，无致病基因3、 感受态大肠杆菌的制备制备原理：当细菌处于0°C、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42C短时间热冲击后吸附在细胞表面而利于进入，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。4、外源DNA导入细菌的几种方法（1）转化 （2）转染（3）转导5、 重组质粒导入受体的转化方法（1）热激法或热休克转化法 （2）电转化法 （3）平板培养细菌6、 重组DNA导入真核细胞（1）酵母细胞 ①利用原生质体进行转化 ②利用Li+盐进行转化（2）植物细胞 ①农杆菌介导法 ②电击法 ③基因枪法（3） 哺乳动物细胞①磷酸钙沉淀法②脂质体（lipofectin）载体法③显微注射法③DEAE-—葡聚糖转染法7、 重组体克隆的筛选和鉴定①遗传表型直接筛选法 ②DNA电泳检测法 ③核酸杂交检测法免疫化学检测法转译筛选法 ⑥真核生物常用的重组基因选择方法 ⑦DNA序列测定8、 根据载体的抗药性标记进行筛选PBR322抗菌素标记选择（图已省---打出来黑的）四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因-半乳糖苷酶显色反应选择法9、 核酸杂交检测法①Southernhybridization原理根据毛细血管作用的原理，使在凝胶电泳中分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，成为DNA印迹杂交技术。也称Southern杂交Northernhybridization原理指根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分离的RNA转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移RNA片段，称为RNA印迹杂交技术，也称为Northern杂交（Northernblot）Dotblothybridization原理在杂交的基础上发展起来的用于快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂交检测。Colonyandplaquehybridization原理将菌落或噬菌斑直接转移到滤膜上，使溶菌班变性的DNA同滤膜原位结合，然后进行杂交测验。杂交后根据杂交信号及其相对应的菌落或噬菌斑的位置，便可从大量菌落或噬菌斑中筛选出含有目标基因序列（与探针同源）的菌落或噬菌斑。所以，有时也称菌落（噬菌斑）原位杂交。11、酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理：一抗（primaryantibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗的特异性结合。酶联（enzyme-link）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。12、 一般克隆与筛选策略13、 HAT法原理选择培养基中有次黄嘌吟、氨基喋啉和胸苷，培养基中的氨基喋啉阻断细胞核苷酸的全程合成，但启动以次黄嘌吟为底物进行核苷酸的补救合成途径，不受氨基喋啉的抑制，另外培养基中的胸苷可通过胸苷激酶的作用合成核苷酸，tk+能合成核苷酸，而tk-不能合成而死亡。14、 二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（看图背原理）（1） 选择原理二氢叶酸还原酶的必要性：真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌吟的培养基中生存，不需要补救！DHFR-细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。不能在无胸昔和次黄嘌吟的培养基中生存。当加入胸苷和次黄嘌吟，DHFR-细胞可通过补救合成途径维持生长。需要补救！胸昔和次黄嘌吟补救无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，胸昔和次黄嘌吟分别补救：（2） 选择过程①宿主细胞DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。需要胸苷和次黄嘌吟补救！无核昔酸的培养基透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。氨甲喋嘛“加压”添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。载体标记DHFR+基因。只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。15、 报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。16、 几种常用的报告基因（1）大肠杆菌的P-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （6-D-glucuronidase，GUS）；（2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase，luc）；（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （GreenFluorescentProtein）。17、 DNA序列测定的方法（1） 化学降解法测序原理:一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。造成碱基的特异性切割，由此产生的一系列具有不同长度的DNA寡聚核苷酸链，经凝胶电泳分离和检测，读出核苷酸序列。（2） 双脱氧链终止法测序原理：（1）DNA聚合酶在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，能利用单链的DNA作为模板合成出准确的DNA互补链；（2）如果加入双脱氧三磷酸核苷（ddNTP），由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而终止DNA链的延长。即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。18、双脱氧终止法测序反应体系包括:①DNA聚合酶单链DNA模板引物，通常由20-23个碱基构成，G+C=12,A+T=8到11，Tm=60-68°C，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构Mg2+4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)第六章外源基因的表达1、 外源基因的表达系统：基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。2、 外源基因的有效表达关键：起始转录。3、 mRNA的延伸与稳定性：外源基因的有效表达的关键：保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在。构建载体需考虑因素：①避免非特异性终止，加入抗终止序列；②加入正常转录终止序列，减少DNA反向转录为反义mRNA的机会；③选择受体菌Rnase缺失(原核)；④加入poly(A)的信号序列AAUAAA有利于mRNA的正确加工(真核)。4、 表达蛋白在细胞中的稳定性几个方面考虑：①融合蛋白，外源蛋白与受体蛋白有良好的杂合构像；②分泌蛋白，外源蛋白能分泌到细胞周质腔或直接分泌到培养基；③包涵体，外源蛋白以包涵体的形式存在与于受体细胞；④选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统5、融合蛋白的优点:①融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。②可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。③原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。④目的蛋白溶解性好，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。6、分泌蛋白的优点:①目的蛋白稳定性高；②目的蛋白易于分离；③目的蛋白末端完整。7、包涵体形式的优点:①能简化外源基因表达产物的分离操作；②能在一定程度上保持表达产物的结构稳定8、启动子：能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的DNA序列。9、启动子的分离：①随机克隆法；②聚合酶保护法；③过滤膜结合法；④PCR扩增法10、随机克隆法:①选用适当的核酸内切酶消化切割的染色体DNA分子；②接着将切割产生的DNA限制片段与一种无启动子的质粒载体重组，使克隆的