基因工程抗体及其发展前景课件

基因工程抗体及其发展前景主要内容1、抗体的一些基本概念：2、基因工程抗体的基本原理：3、人源化抗体制备的主要方法：4、单克隆抗体的市场需求：5、工程抗体的未来展望：第一节：抗体的一些基本概念：1、免疫球蛋白的基本结构四肽链结构

，链间二硫键连接两条重链（H）和两条轻链（L）氨基端和羧基端。

(1)根据重链分类：根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列顺序不同，将重链分为种：γ、α、μ、δ、ε

根据重链组成不同，将Ig分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE(2)根据轻链分型：κ、λ型

天然Ig分子中，重链同类，轻链同型2、重链与轻链3、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶(papain)水解IgG：得到两个相同的Fab段和一个Fc段。4、免疫球蛋白的水解片段胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一个具有双价活性的F（ab’）2段和若干个小分子多肽碎片（pFc’）5、多克隆和单抗抗体制备VH和VL:识别和结合抗原CH和CL:同种异型的遗传标志CH2:补体C1q结合位点，IgG可通过胎盘CH3/CH4:与多种细胞表面的FcR结合(免疫调理,I型超敏反应)6、各功能区的作用第二节：基因工程抗体的基本原理

(antibodyengineering）Antibodyhasahigherspecificityandaffinitytobindtotargetprotein.

抗体药物(drug)：可以针对人体内细胞生命过程中一些重要的

生理和病理药物靶点，发挥特异性治疗作用。基因工程抗体的分类1.人源改造抗体（1）嵌合抗体（chimericantibody）（2）人源化抗体（humanizedantibody）（3）完全人源抗体

（Fullhumanantibody)人源性60%-70%人源性90%-95%抗体药物在应用中存在的问题：一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗，必须人源化，在临床上可减少异源性蛋白所引起的过敏反应和增加疗效。鼠源抗体人源化后，抗体效价明显降低，导致临床疗效降低。临床治疗需要大量的抗体(克级），故需要生物反应器制备抗体。由于抗体的产量和质量受到限制，而影响疗效。问题:工程细胞系,大规模生产工艺技术基因工程抗体的优点和缺点优点：不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。缺点：基因操作使得抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。目的：减小鼠源性成份，降低HAMS反应（humanagainstmousesyndrome)。易于大规模生产和应用于临床。保留抗体的抗原结合能力。基本原理：借助基因工程手段，将编码Ab的重轻链可变区基因重组到真核表达载体上并进行表达。基因工程抗体的表达原核细胞和酵母可以用于表达小分子抗体和抗体片段大部分完整抗体和双链抗体、微型抗体等需要在CHO等哺乳动物细胞中表达利用完整的动植物体通过转基因的方法表达外源蛋白：如利用转基因烟草生产抗狂犬病毒抗体,抗Ebola病毒抗体。基因工程抗体的分类2.小分子抗体（1）Fab片段（2）单链抗体（singlechainantibody，scFv）、双链抗体、三链抗体（3）微型抗体（minibody，两个scFv与抗体CH3区连接）（4）双特异性抗体（diabody）（5）其他形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）基因工程抗体的分类第三节：基因工程抗体制备的主要方法：1.人鼠嵌合抗体

（ChimericAntibodies）原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合。缺点：鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS反应，humanagainstmousesyndrome)。嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力明显下降。Chimericantibodies杂交瘤细胞株获得两个可变区克隆载体(T载体)原核表达系统检测构建表达载体RT-PCR酶切测序酶切，连接转化是是否否酶切，连接1。获得鼠单抗重轻链可

变区的基因片段。2.基因片段插入含有人IgG重轻链恒定区的表达载体。人鼠嵌合抗体的真核表达在CHO细胞（共转染模式和单载体转染模式）

Until2003,7，8437peoplehavebeeninfectedwithSARSoverthe32countries,inwhich813patientswerediedformdisease.Thediseaseincidenceisabout10.5%.Therearemanyunresolvedquestionsaboutdiseasepathogenesis,treatmentanddiagnosis.TwoSARSNeutralizingAbwereproduced.FEBSLetters579(2005)2130-2136ACE2bindingregionCellfusionregion310518Tomakehuman-mousechimericmAbAngiotensin-convertingenzyme2(ACE2)isthefunctionalcellularreceptorofSARS-CoVNeutralizingantibodycanblockthisprocesssothatSARSvirusesareunabletoinfectthetargetcells.2.TreatmentSpikeproteinisthemaintargetofneutralizingantibodiesHeetal.BBRC324(2004)773–781VaccineAsanAntigenAsascreenAgTwocloneshavebeenselectedandtestedbyELISA(mAbascites)Thetiterofascitescanreach1:5120,000InvitroevaluationofSARSMab’sneutralizingeffect

1.SyncytiaInhibitionAssay2.Pseudovirusinfectionassay3.SARSVirusNeutralizationAssaySyncytiaInhibitionAssay.FEBSLetters2005,579:2130-2136SyncytiaFormationassayhasbeendevelopedintheLab.ThesystemisvaluableindetectingtheinteractionbetweenACE2receptorandspikeproteinofSARS.Theanti-SARSneutralizingmousemAbisbeingengineeredintomouse-humanchimericmAbwhichhasatherapeuticactivityinhuman.

mAbSyncytiaInhibitionAssay:Mouseantiserumafterthesecondimmunization

SyncytiaInhibitionAssay:S-9-11mabascites

SyncytiaInhibitionAssay:N-176-15mabascitesSARSVirusNeutralizationAssayThetypicalearlycytopathiceffectwasobservedinSARS-CoVinfectedcultured-cellsinP3labofHongKongUniversityS-9-11SARSVirusNeutralizationAssayinP3labHongKongDilution12345678910111280

160

320

640

1280

2560

5120

10240

+++++++

Thedilutionrateoftheascites:1:5000ChimericmonoclonalantibodyproductionN-176-15monoclonalantibodyaasequenceVH+CH1:(Signalsequence)MGWSWIFLFFLSGTAGVLSEVLLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQRHGKSLEWIGDINPKSGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARTRYGTSYDYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKI

VL+CL:(Signalsequence)METDTLLLWVLLLWVPGSTGDILLTQSPASLTVSLGQRASISCRASQSVSTSRFSYIHWYQEKPGQPPKLLINYASNLDSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWENPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSReceptorBindingDomain318510128OverlappingpeptidesthatcovertheRBDprotein671015ResultsofcomputerpredictionnitnlCpFGEvFNATkfpsvyawerkkisnCVADysVLynstFFstfkcygvsatklndlcfsnvyadsfvvkgddvrqiapgqtgviadynyklpddfmgcvlaWNtRNIDATstGnyNYkyrylrhgklrpferdisnvpfspdgkpctppalncywplndygfytttgigyqpyrvvvlsfellnapatv

RBDsequence:Bluecapitalletters:potentiallycrucialaminoacidsforthebindingCombinetheresultsofthedot-blotandthecomputerpredicitontogethernitnlCpFGEvFNATkfpsvyawerkkisnCVADysVLynstFFstfkcygvsatklndlcfsnvyadsfvvkgddvrqiapgqtgviadynyklpddfmgcvlaWNtRNIDATstGnyNYkyrylrhgklrpferdisnvpfspdgkpctppalncywplndygfytttgigyqpyrvvvlsfellnapatv

RBDsequence:Underlinedletters:peptidesrecognizedbytheneutralizingmabsSite-directedmutationMutationsite:VADAAAVLAAFFAAWNAARNIAAASandwichELISAtodeterminethebindingeffectofmutatedRBD-FcproteinCrucialbindingsitesforthemAbare423Wand424N(WN).Unshowndata:monoclonalantibodyagainstSARSSproteintestedtheproperexpressionofthesemutatedproteinsSpecialaminoacids(423Wand424N)areessentialtoberecognizedbytheneutralizingmAbs.Thetworesiduesareconservedinallstrainsisolatedfromhuman.(Virology,2008)Purple:ACE2Brown:RBDYellow:Epitope2.humanizedantibodies"Humanization"or"reshaping"ofmurineantibodiesisanattempttotransferthefullantigenspecificityandbindingavidityofmurinemonoclonalantibodiestoahumanantibodybygraftingthemurinecomplementaritydeterminingregions(CDRs)ontoahumanvariableregionframework。保留鼠CDR的人源化AbSDRgrafting—anewapproachtoantibodyhumanizationdifferencebetweentheSDRgraftingandtheCDRgrafting3。FullyhumanmAbs

1）。transgenicmice2）。Humanantibody-displaylibraries3）。TomakeHumanmAbfromhumanbeing1）Transgenicmice首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。有许多公司通过协议，提供服务。获得专利使用权。2）噬菌体抗体库技术

(Phageantibodylibrarytechnique)把人的Ig重轻链可变区基因片段展示在l噬菌体表面,组成抗体库。通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。Displayofantibodyfragmentsonbacteriophage

-thefavoredformatofantibodyfragmentissingle-chainFV(scFV)SchematicrepresentationofdifferentantibodyformatswholeAb(150kD)scFV(27kD)FV(25kD)Fab

(50kD)CH2CH3CH1VLCLVHantigenbindingsiteConstructionofantibodylibraries

-DNAsequencesencodingVHandVLdomainsareamplifiedbyPCR-VHandVLdomainsarepairedrandomly,increasingfunctionaldiversityinthelibrary-ThescFVsequencesareamplifiedbyPCRusingprimersincorporatingrestrictionsites-cloningintothephagemidvector

DisplayofFabfragmentsonfilamentous

phage.

-transformedintoE.colibyelectroporation-afterrescuewithhelperphage,therandomcombinatoriallibraryofantibodiesisdisplayedonphageAntibodydisplaylibraryLibrarysizeanddiversity-Specificityandaffinityaredesirablequalitiesinanyantibody-Thelargerthelibrary,thegreaterthelikelihoodthatitwillcontainanantibodyofveryhighaffinityhavingthedesiredspecificity。

SelectionofspecificantibodiesfromaphagelibraryAmplificationWashEluteAntibodylibraryonphageAntigencolumnNextpanningcycleSelectionofabindingspecificityfromaphagedisplaylibraryNaïveorimmunizedKeypointFunctionalAbHigh-throughputselections

-smallvolumesofliquid(100μl)arerequired-multiwellmicrotiterplates-adifferentantigenmaybecoatedontoeachwellPhageantibodiesasreagents

-PhageantibodieshaveroutinelybeensuccessfulinELISAonproteinorpeptideantigensELISAonwholecellsorsubcellularfractionsflowcytometryimmunocytochemistry

3）用人的骨髓瘤细胞直接制备

全人抗体关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高。(Humanantibodies2002,11:85-96)MousemyelomaHumanmyelomaDoubleselectingmarkers

G418andHATHumanLNBcellsBreastcancertissueBreastcancercellsWeworkonHCV/E2mAbandRabbisvirusSproteinbyusingFMP2cells.4.B细胞永生化技术：用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆。这一技术较为成熟，但是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。Volunteers/patientsscreening

5.PlatformforthedevelopmentofhumanmAbsusingsingle-cellRT-PCR流感病毒流感病毒侵入呼吸道的纤毛柱状上皮内进行复制，释放后再侵入其他上皮细胞。受染的细胞发生变性、坏死和脱落，局部有炎症反应，流感病毒一般不侵染下呼吸道，并导致肺炎。流感的大流行在过去的一百多年中，人类社会发生过5次大的流感大流行，损失及其惨重。1、1918，“西班牙流感”，“人类现代史上最大的一次瘟疫”，全球死亡率约为3%，约有5000万人死亡。H1N1亚型引起。2、1957～1958，“亚洲流感”，始与我国贵州，全球200万人死亡。H2N2亚型引起。3、1968～1969，“香港流感”，全球大约100万人死亡，H3N2亚型引起。4、1977，“苏联流感”，累及人群主要是青少年，但没引起全球性大流行。H1N1亚型引起。5、2009，“甲型H1N1流感”，起源于北美，波及230余个国家，超过1.8万人死亡。H1N1亚型引起。6、2013，H7N9起源于上海地区，感染134人，死亡率30%。HemagglutininTheHAproteinisthefunctionalproteinthatmediatesentryoftheinfluenzavirusesintosusceptiblehostcellsandthuscontainsvariousepitopesthatarerecognizedbyneutralizingantibodies.Itsglobularhead(HA1)region,whichisoftenmutated,isthemaintargetofthehumoralimmuneresponse.研发广谱人源中和性抗体TechnicalRoute:Volunteerwhohasbeenvaccinedby2009A/H1N1InfluenzavaccinePBMCFicollHACD19+IgG+FACSsortingSpcificsingleB-cellsecretingantibodyagainstinfluenzavirusSinglecellRT-PCR96-wellPCRplateobtainheavychain(γ)

andlightchaingenesequence(κtoλ)IggenesequenceanalysisExpressionvectorcloningRecombinantantibodyproduction&purificationinvitro/invivocharacterizationepitopeidentificationIsolationofHAspecificmemoryBcells19Absobtainedbysingle-cellRT-PCRcanrecognizeantigenHA

VgenesofthehumanmAbsBindingabilityofthemAbstotheantigen7mAbscontaintheabilityofneutralizingdifferentsubtypesofinfluenzavirusesHumanmAbsrecognizethefusionpeptideinHA2TherecognizedfusionpeptidesequenceInhibitionofcell–cellfusionbythebroadlyneutralizingmAbsA:noAbsB-H:inthepresenceof100mg/mlofbroadlyneutralizingmAbsI:positivecontrolJ:controlAbs初步的动物实验表明，所获得的全人抗体可以治疗甲型H1N1流感和高致病性H5N1禽流感对小鼠的感染。图中显示小鼠体重变化和存活率ConservedB-cellepitopebaseduniversalinfluenzavaccinedevelopmentHA2由于其良好的型间保守性，是流感广谱疫苗研发的重要候选靶标trimer-dependentepitopestrimer-independentepitopes3E1Fab-HAtrimerA/washington/2011(H1N1)

3E1-Fab与HA三聚体复合物结晶3E1识别HA的模式是没有文献报道的.3E1识别与Ahelix，fusionpeptide以及βsheet有关的空间构像表位鉴定:晶体结构3E1识别HA的表位表位鉴定:X射线晶体衍射第四节、抗体工程的发展历程和应用动物多克隆抗血清被抗生素所代替成份复杂，副反应严重鼠源单克隆抗体1975年，杂交瘤技术制备单抗成功“魔弹”HAMA反应20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症遭遇失败。抗体药物的研究进入低谷。分子生物学基因工程技术基因工程抗体鼠源抗体的人源化及形式多样的改造抗体抗体工程就是指利用分子生物学、基因工程等手段对抗体进行各种不同的改造并在原核、真核细胞中表达制备的工程技术。治疗性抗体-已上市的主要抗体药物及靶点>17家公司有抗体药物上市

2012年总销售额大于US$50bn

Top5:Herceptin®,Avastin®,

Humira®,Rituxan®&Remicade®10/45是全人抗体18/45治疗性抗体是人源化抗体9/45是嵌合抗体7/45是鼠源单克隆抗体抗体药物全球市场Nat.DrugDis.2010.doi:10.1038/nrd3229目前全球销售额最高的6大类生物技术药物：抗肿瘤药物anti-TNFα药物EPO胰岛素β-干扰素凝血因子截至目前，全球已有200余种生物技术药物获准进入市场，1000多种处于临床试验的不同阶段。其中接近一半为抗体药物。目前生物技术药物各门类销售额占比抗体药物的应用领域抗器官移植排斥反应；肿瘤导向治疗；哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病；心脑血管疾病；感染性疾病；其他抗体药物市场巨大，前景广阔。应用领域：抗肿瘤、抗自身免疫病、抗感染为主。开发类型：人源化及全人为发展方向。目前单抗用作治疗药物的研究趋势为：1.寻找新的分子靶点；

2.抗体的人源化；

3.偶联物分子的微小化；

4.单抗药物的高效化；

5.双特异性抗体以激活宿主效应细胞；

6.改变某些氨基酸以增加抗体的亲合力；

7.抗体导向的酶活化前体药物技术。抗体药物的作用机制Nat.Rev.Immunol.2010.Vol.10.301-316第五节：工程抗体的未来展望：Gazyva（obinutuzumab，又名GA101）获FDA批准，联合苯丁酸氮芥（chlorambucil）化疗，用于既往未经治疗的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者。首个糖基化的II型抗CD20单克隆抗体，这意味着GA101中的特定糖分子能够被修改，来改变其与人体免疫细胞的相互作用。这种修饰作用，创造了一种独特的抗体，旨在作为一种免疫疗法，利用患者自身的免疫系统来帮助攻击癌细胞。此外，GA101与CD20的结合，能够直接诱导细胞死亡。

GA101旨在增强抗体依赖性细胞毒性作用（Antibody-DependentCellularCytotoxicity，ADCC）及直接的细胞死亡诱导作用（DirectCellDeathinduction）。近期值得关注的研究进展Nivolumab（BMS-936559）一种实验性、全人源化IgG4、抗程序性死亡受体