基因工程及应用课件

基因工程及应用溧阳市埭头中学孙定川

随着社会的发展，人们的需求越来越趋于多样化，人们希望按照自己的意图改变物种的基因，以期获得新的性状、得到新的生物产品。经典遗传学主要通过自然选育来挑选已发生自发突变的新变种；通过用物化因子（如辐射、药物处理等）来进行人工诱变，得到所需的性状；通过细胞杂交使得某种突变性状得以显现，从而寻找新类型。但所有这些，都具有相当大的偶然性，效率不高，难以真正看到基因。由于经典遗传学所研究的基因不能离开染色体而独立进行复制，所以基因拷贝数的增加是有限的；由于染色体减数分裂受同源性的支配，远缘杂交难以实现。人们强烈希望新的育种方式出现。在疾病防治方面，有许多严重威胁人类健康的病症，如遗传性疾病、心血管病、恶性肿瘤、免疫系统疾病等，病因还不太清楚。解决这些问题，必需依赖于生命科技甚至整个科学技术的革命.在上世纪中下叶，科学进步的机遇终于到来，这就是分子生物学理论的创立和突破性进展，特别是基因工程（遗传工程）-----DNA体外重组技术的出现。生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果，各种生物间的性状千差万别这是为什么呢？

问题：例：1．青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素。

2．豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气。

3．人的胰岛B细胞能分泌胰岛素调节血糖的浓度。

小结：这些性状都是基因特异性表达的结果人类能不能改造基因呢？能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢？问题：标准概念：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“切割”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。因此，基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术一、基因工程的概念

通俗概念：按照人们的意愿，把一种生物的个别基因复制出来加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平剪切拼接导入表达人类需要的基因产物一、基因工程的基本内容基因工程，兴起于20世纪70年代。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想，是在核酸限制性内切酶、载体质粒、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后。在此基础上，核酸和蛋白质序列测定、基因体外快速突变、DNA的人工合成等，则使得基因工程逐渐成熟和发展。通过对基因工程概念的理解，我们知道其操作水平是在DNA分子水平，用普通的操作工具能够在如此微观的条件下操作吗？

问题：基因操作的工具苏云金芽孢杆菌（有抗虫特性）抗虫基因普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞（含抗虫基因）导入与运载体DNA拼接棉花植株（有抗虫特性）关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞关键步骤一的工具：基因的剪刀——限制性内切酶关键步骤二的工具：基因的针线——DNA连接酶关键步骤三的工具：基因的运输工具——运载体思考：关键步骤是什么？（难题）①分布：②作用特点：

③结果：

④举例：主要在微生物中。特异性。一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，在特定的切点上切割DNA分子。产生黏性未端（碱基互补配对）。大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。

思考题：要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性未端？

（1）基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）限制酶切割DNA分子示意图DNA连接酶的连接作用示意图被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性未端。可以设想，如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性未端黏合起来，似乎就可以合成重组的DNA分子了。但是，实际上仅仅这样做是不够的，互补的碱基处虽然连接起来，但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的氢键（踏板）连接起来，两边的扶手的断口处还没有连接起来。要把磷酸二酯键（扶手）的断口处连接起来，也就是把两条DNA未端之间的缝隙“缝合”起来，还要靠另一种极其重要的工具——DNA连接酶。

（2）基因的针线——DNA连接酶（图示）DNA连接酶的连接作用示意图

①连接的部位：

②结果：

思考题：

磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。

两个相同的黏性未端的连接。

用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？

用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？

（2）基因的针线——DNA连接酶（图示）（3）基因的运输工具——运载体（图示）①作用：

②具备的条件：

③种类：

将外源基因送入受体细胞。

能在宿主细胞内复制并稳定地保存。

具有多个限制酶切点。

具有某些标记基因。

质粒、噬菌体和动植物病毒。

大肠杆菌质粒的分子结构示意图质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用，但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。

质粒是基因工程最常用的运载体，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒中常含有抗药基因，如抗四环素的标记基因。细菌质粒的大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一左右。质粒存在于许多细菌及酵母菌等生物中。

质粒的存在对宿主细胞无影响。

质粒的复制只能在宿主细胞内完成。

细胞染色体外能自主主复制的小型环状DNA分子。

思考题：

1、质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？④质粒的特点：

基因操作的基本步骤示意图三、基因操作的基本步骤（图示）问题：①举例说明什么是目的基因？获得目的基因的途径如何？

②从供体细胞DNA中直接分离基因的最常用的方法叫什么？简要说出该方法的过程是什么？

③人工合成基因的方法有几种？其操作过程分别是什么？从供体细胞的DNA中直接分离基因方法：鸟枪法（1）鸟枪法的过程：（一）提取目的基因的途径反转录法（2）反转录法的过程：根据已知氨基酸序列合成DNA人工合成基因（真核细胞）运载体供体细胞中DNA许多DNA片段限制酶载入导入受体细胞产生特定性状目的基因分离外源DNA扩增目的基因的mRNA单链DNA反转录双链DNA（即目的基因）合成（3）根据已知氨基酸序列合成DNA的过程蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测化学合成推测DNA合成仪另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因，胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

目前人工合成基因的方法主要有两条途径。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。①目的基因是指人们所需要的特定基因，有两条途径。②鸟枪法，其过程是：此法的优点：操作简便

缺点：工作量大，专一性较差，分离出来的有时并非一个基因，具有一定的盲目性。③人工合成基因法1反转录法：目的基因mRNA单链DNA

双链DNA转录逆转录互补合成供体细胞中的DNADNA片段重组DNA不同受体细胞DNA扩增目的基因的细胞分离目的基因限制酶运载体找出2根据已知的氨基酸序列合成DNA：由蛋白质中的氨基酸序列

mRNA中碱基序列DNA碱基序列目的基因推出推测出化学合成小结：2、目的基因与运载体结合步骤：（1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现2个有粘性末端的切口。（2）用同种限制酶切断目的基因，产生相同的粘性末端。（3）将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒思考题：目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？（有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。）3、将目的基因导入受体细胞

导入方法：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。导入过程：（运载体为质粒，受体细胞为细菌，一般是将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞）4、目的基因的检测和表达

检测：方法很多，通过检测运载体的标记基因的有无，来判断目的基因是否导入

表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。

问题：1、如何检测受体细胞是否真正导入了重组DNA分子？2、如何来确定目的基因是否得以表达？例如：大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞以后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。例如：科学家最初做抗虫棉实验时，已经检测出棉的植株中含有抗虫基因，但却无抗虫效果，这说明了什么？科学家在研究的基础上对棉植株中的抗虫基因进行了修饰，结果很快出现了抗虫性状，这说明了什么？总结：基因操作的基本步骤：细菌取出质粒用相同的限制酶切出粘性末端供体细胞取出DNA分子用限制酶切取目的基因将目的基因插入质粒切口用连接酶将目的基因与质粒相连将重组DNA分子导入受体细胞重组DNA分子增殖、表达目的基因产物二、基因工程的基本程序基因工程的基本程序是：（1）获得目的基因（外源DNA片段）（2）将目的基因连接到载体上；（3）将将目的基因（环状的DNA）引入宿主细胞（受体细胞）；（4）目的基因的检测和表达

载体质粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞扩增abbAAb

例题解析1、

农业上大量使用化肥存在许多负面影响，“生物固氮”已成为一项重要研究课题，实验证明，生物固氮是某些微生物（如根瘤菌、蓝藻等）将空气中的N2固定为NH3的过程。（1）与人工合成NH3所需的高温、高压条件相比，生物固氮的顺利进行是因为根瘤菌、蓝藻体内含有特定的

，这类物质的化学本质是

。（2）人们正在着力研究转基因固氮植物（如固氮水稻、固氮小麦等），某科学家将根瘤菌、细胞中的固氮基因，通过基因工程方法转移到水稻植株细胞中，经检测，转基因水稻具备了固氮功能。据上述材料分析：①固氮基因已经整合到水稻细胞的

中。②写出水稻细胞中固氮基因得到表达的反应式。酶蛋白质DNA

转录翻译DNA（固氮基因）RNA蛋白质2、干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵，平民百姓用不起。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：（1）从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的

，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来

。（2）酵母菌能用

方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产

。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。基因产生干扰素出芽干扰素3、细菌通常是具有双链环状DNA的单细胞生物。现有甲、乙两种细菌，基因型分别是abd和ABD，通过基因工程使甲细菌后代产生出乙细菌B基因所控制的产物，具体过程如图所示，试据图回答。（1）从细胞的结构看，细菌属于

生物。（2）图中剪切DNA的“剪刀”和粘接DNA的“胶水”，其实是两种不同的酶，它们都只能在DNA的一定位置进行剪切和粘接，说明它们具有

的特点。（3）新细菌与甲、乙细菌的表现都不同，从变异来源看，这是人工条件下的一种

。（4）假如B基因是来自人体细胞，则甲子代也可产生出相应的人体物质，这说明在翻译过程中，细菌和人类共套

。（5）在DNA分子中“拼接”上某个基因或“切割”掉某个基因，并不影响各基因的功能，这说明基因具有

原核专一性基因重组遗传密码相对的独立性4、“人类基因组计划”的研究工作已经历时10年，投资近百亿美元。一开始它是一项“国际参与，免费分享”的国际合作研究项目，现在由于其潜在的巨大经济价值，使得它还未完成时，争抢就已经开始，而且愈演愈烈的趋势。起步本已较晚的我国生物科技人员还面临着经费严重不足等巨大困难，但是他们说：“我们的民族已经在信息产业的上游-----软件和硬件上受制于人，我们再也不能让我们的子孙后代在这个领域付出代价！”当该课题组的杨焕明、汪键在没有研究经费的情况下找袁隆平帮忙时，袁隆平爽快地道：“拿合同来”。（1）从细胞学上讲，基因的载体是

其排列特点是

。（2）文中的“基因序列”指

，因为它代表控制生命活动的全套

，所以基因序列的测定对于探索生命奥秘意义重大：（3）“编码基因”一词中的“编码”，是指为生命活动的体现者

编码。（4）文中袁隆平是我国的

专家，他使用的方法主要是

。（5）与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是

和

的障碍。染色体线性排列基因脱氧核苷酸的排列顺序遗传密码蛋白质杂交育种缩短育种时间克服远缘杂交13、在药品生产中，有些药品如干扰素、白细胞介素、凝血因子等，以前主要是从生物体的组织、细胞、血液中提取的，由于受原料来源限制，价格十分昂贵，而且产量低，临床供应明显不足。自20世纪70年代遗传工程发展以来，人们逐步地在人体内发现了相应的目的基因，使之与质粒形成重组的DNA分子，并以重组DNA引入大肠杆菌，最后利用这些工程菌，可以高效地生产出上述各种高质量低成本的药品，请分析回答：⑴在基因工程中质粒是一种最常用的

，它广泛地存在于

细胞中，是一种很小的

分子。⑵在用目的基因与质粒形成重组DNA过程中，一般要用到的工具酶是和

。⑶将含有“某激素基因”的质粒导入细菌细胞后，能在细菌细胞内直接指导合成“某激素”，则该激素在细菌体内的合成包括

和两个阶段。⑷细菌中质粒能由一个变成两个，二个变成四个……，质粒的这种合成方式在分子遗传学上称为

。

⑸在将质粒导入细菌时，一般要用

处理细菌，以增大

。基因的运载体

细菌

DNA

限制性