大肠杆菌提取DNA

中文摘要目的：用试剂盒法和碱法提取P16重组质粒的比较。方法：1.5ml菌液移入50mlLB液体培养基中培养12h，将试剂盒法和碱法各分3组，每组加入3.0ml菌液，每种方法中有两组是对照试验；紫外分光光度计法测OD值；酶切；琼脂糖凝胶电泳。结果：碱裂法的OD值分别为：1.583；1.575；1.735,质粒DNA的浓度为：3.060；3.150；2.370。试剂盒法的OD(260/280)值为：1.614；1.605；1.656。质粒DNA的浓度为：；0.390；0.420；0.600。结论：碱法与试剂盒法用统计学分析没有显著差异。试剂盒法简单、快捷，DNA纯度高，但质粒DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，并且试剂盒价格昂贵，碱法价格低廉，质粒DNA的浓度高，提取质粒DNA的量多，所以具有较强的实用性，适用于一般实验室研究工作。关键词：质粒；试剂盒法；碱法；AbstractPurpose:Drawthecomparisonthatp16recombinatedtheplasmidwiththereagentboxlawandalkalilaw.Method:1.5mlfungusliquidmovein50mlLBliquidculturetrain12h,reagentboxlawandalkalilawall3group,everygroupjoins3.Thefungusliquidof0ml,therearetwogroupsthataretestedbythecontrastineachkindofmethod;ThelawofpurpleotherspectrophotometerexaminesODvalue;Theenzymeiscut;Agar-agarcandygelelectrophoresis.Result:ItsplitalkaliODthelawoneincluding:1.583;1.575;1.735,thedensityofplasmidDNAis:3.060;3.150;2.370.WhetherreagentOD(260/280),boxoflawvalueis.1.614;1.605;1.656.ThedensityofplasmidDNAis:;0.390;0.420;0.600.Conclusion:Alkalilawandreagentboxlawanalysewithstatisticsthatthereisnotremarkabledifference.Thereagentboxlawissimple,swift,DNAishighinpurity,butthedensityofplasmidDNAislow,thereislittlequantityofdrawingplasmidDNA,andthereagentboxcostsanarmandaleg,thealkalilawischeap,thedensityofplasmidDNAishigh,thereismuchquantityofdrawingplasmidDNA,sohavestrongerpracticability,suitablefortheresearchworkofgenerallaboratory.Keyword:Plasmid;Reagentboxlaw;Alkalilaw;刖言P16基因又叫MTS(multipletumorsuppressor1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。P16基因已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现。纯合子缺失以及无义、错义及移码突变，表明P16基因以缺失，突变方式广泛参予肿瘤形成，检测P16基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。质粒是在核体外游离的小型双股DNA分子。多为共价闭合环状，也发现有线状，分子量在106-108之间。质粒基因组约为核体的1%，含细菌生命非必需的基因，其功能是控制产生菌毛、毒素、耐药性和细菌素等遗传性状。质粒能独立复制，随宿主分裂传给子代菌体，有些质粒能与核体DNA整合或脱离，这类质粒称为附加体。质粒具有与外来DNA重组的功能，所以在基因工程中被广泛应用为载体。质粒不同，在宿主细胞中的拷贝数也不同。根据质粒在细胞中拷贝数不同按Rownd的建议，把质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。严紧型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒。其DNA的复制与宿主染色体DNA的复制相偶连，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。分子量较大，自身传递是这类质粒的特点。松弛型质粒多半是分子量最小、不具传递能力的大质粒。其复制是在松弛控制之下进行的，每个细胞的拷贝数约10-200个。当向培养基中加入氯霉素时，细菌蛋白质的合成被抑制，细菌染色体DNA和严紧型质粒DNA的复制停止，松弛型质粒DNA的复制继续进行，拷贝数甚至可达到数百个。基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。质粒的提取的方法很多，常用的有碱法、煮沸法和试剂盒法。试剂盒法虽然效果好，但由于价格昂贵，如果需要大量使用将会增加实验所需成本；而碱法少量提取法效果近似试剂盒法，而且实验成本低，用这种方法提取的质粒DNA不仅可以满足本实验室遗传工程实验的要求，还可以满足大多数分子生物学常规实验的需要，并且结果稳定性好又经济，对实验设备要求不高，非常适合大多数实验室使用。本次试验仅用碱法和试剂盒法进行对比。1材料和方法1.1材料1.1.1试剂菌液（含PCR-P16）:畜牧兽医学院中心实验室保存酚；酚：氯仿（1:1）；氯仿；无水乙醇：沈阳第一试剂厂70%乙醇；无DNA酶的RNA酶；EcoRI酶及缓冲液：宝生物工程（大连）有限公司XhoI酶及缓冲液；DNAMarker:宝生物工程（大连）有限公司10XLoadingBuffer：宝生物工程（大连）有限公司TAE缓冲液；漠乙锭；琼脂糖；试剂盒：V-geneBiotechnologyLimited1.1.2仪器1.5ml消毒的聚丙烯离心管数个；台式离心机TGL—16B上海安亭科学仪器厂制造；TGL—16BHZQ—X100水浴振荡器哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;电泳仪；DYY-5型电泳槽；DYCp-31D冰箱；电热恒温培养箱上海精密实验设备有限公司；天平；LIBROREB-280分光光度计（SHIMADIUSPECTROPHOTOMETERUV-120-02）；微波炉；紫外线检测仪；捷达科技微量移液器；PH仪漩涡混合器（XW-80A上海精科实业有限公司）1.1.3主要溶液的配制LB液体培养基的配制：TOC\o"1-5"\h\z细菌培养用胶化蛋白胨 0.5g细菌培养用酵母提取物 0.25gNaCl 0.5g去离子水 47.5mL搅拌溶解后，加入5mol/L的NaOH调节PH至7.0，加入蒸馏水至总体积为50ml,高压灭菌20min(1.034X105pa,温度121°C)。STE的配制：NaCl 0.1mol/LTris・Cl(PH8.0) 10mmol/LEDTA 1mmol/L溶液I的配制：葡萄糖 50mmol/LTris・Cl(PH8.0) 25mmol/LEDTA 10mmol/L该溶液可以配制成100ml，在10bf/in2(6.896X104Pa)高压下蒸气灭菌消毒15分钟，贮存于4C。溶液II的配制：(新鲜配制)NaOH 0.2mol/LSDS 1%溶液III的配制：5mol/LKac 60ml冰醋酸 11.5mlHO 28.5ml2配制好的溶液I含3mol/L钾盐，6mol/L醋酸(PH4.8)TE缓冲液的配制：(PH8.0)Tris・Cl(PH8.0) 10mmol/LEDTA(PH8.0) 1mmol/LDNA酚/氯仿抽提液的配制：将平衡酚溶液与氯仿溶液等体积混合，用0.1mol/LTris-HCI(PH7.6)反复抽提，从而平衡这一混合物。，然后将培植的溶液置入棕色瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCI(PH7.6)液层，保存于4C。醋酸钠溶液的配制：在80ml中溶解40.81g三水醋酸钠，用冰醋酸调节PH值至6,加水定溶至1L。E.B.溶液的配制:在100ml中加入1g漠乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后转移至棕色瓶中保存于室温。漠乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。1.2方法1.2.1细菌的培养和菌种的保存在装有50mlLB液体培养液的锥形瓶中加入100pl氨苄青霉素(0.5g/ml)。取1.5ml大肠杆菌液移至培养液中，瓶口用灭菌棉塞封口，37°C气浴强烈摇荡过夜。在无菌环境下取出450pl左右菌种，放入Eppendorf管中，在管中注入同体积经过高压灭菌处理过的甘油，用封口膜将管口封住并振匀，在-20C下保存菌种。1.2.2质粒DNA提取的方法碱法提取质粒DNA操作步骤：取菌液1.5ml置于微量离心管A1、A2、A3中，以12000rpm离心30s，弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。再吸取1.5ml菌液置于微量离心管A1、A2、A3中，以12000rpm离心30s，弃去上清液，用滤纸吸十水分，使细菌沉淀尽可能干燥。取溶液I100M分别加入到A1、A2、A3中，剧烈振荡，使其混合均匀；取200闫溶液II分别加入A1、A2、A3中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，使其混匀并接触充分，不要振荡，将其置于冰上。加入150闫用冰预冷的溶液III，盖紧管口将管倒置后温和振荡10秒钟，使溶液I在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，将其置于冰上3-5分钟。以12000rpm离心5min，小心吸取上清液，转移到新的3个离心管中，并加入等量酚：氯仿(1：1)500闫，离心2min，轻轻拿出，吸取上清液约400M(不要碰到蛋白层，宁可少取)。加入2倍容积800M乙醇(室温)，并加入40M醋酸钠，放入冰箱冷冻2h，用微量离心机12000rpm离心5min，上清液，将离心管倒置于滤纸上，吸十水分。加入1ml70%乙醇洗涤双链DNA沉淀，吸去上清液，使沉淀尽可能干燥，放入十燥箱中干燥约30min。用50MTE溶解核酸，振荡，保存于冰箱中，过夜。加入3闫RNA酶，放置37C水浴箱中1h，加500MTE，以12000rpm离心5min，吸取上清液转移到新的3个离心管A1、A2、A3中，并加等量酚：氯仿(1：1)500闫，以12000rpm离心2min。加2倍体积无水乙醇1000ml，再加入40M醋酸钠。放入冰箱中冷冻2h。取出以12000rpm离心5min,弃去上清液，用1ml70%乙醇洗涤双链DNA沉淀。吸去上清液，使沉淀尽可能干燥，放入干燥箱中干燥约30min，直至透明。加入50MTE，保存于冰箱中。试剂盒法提取质粒DNA实验准备：将随试剂盒携带的RNaseA1全部加入BufferS1中，混合均匀，4°C密闭贮存。在BufferW2中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀。室温密闭贮存。操作步骤：吸取1.5ml菌液分别置于3个离心管B「B2、B3中，以12000Xg离心30s，弃尽上清。再吸取1.5ml菌液置于B、B、B中，以12000Xg离心30s，弃尽上清。1 2 3分别在B「B2、B3中，用250闫已加入RNaseA1的BufferS1，用漩涡混合器充分悬浮细菌沉淀：3分别加入250MBufferS2,温和但充分地上下翻转混合4〜6次，不超过5min。BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶解效率。分别加入400MBufferS3，温和地上下翻转8〜10次，室温静置2min。12000Xg离心10min。避免剧烈混合。将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步骤4中的离心上清加入DNA-prepTube中，2500Xg离心1min。弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，分别加500MBufferW1，2500Xg离心1min。弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，分别加入700M已加无水乙醇的BufferW2,2500Xg离心1min，以同样的方法再用700PlBufferW2洗涤一次。将DNA-prepTube置于1.5ml离心管中，12000g离心1min。⑼将DNA-prepTube置于另一清洁的1.5ml离心管B「B2>B3中，在silica膜中央加60闫Eluent，室温静置1min。12000Xg离心1min洗脱DNA，放入冰箱中保存。质粒DNA的酶切在碱法和试剂盒法中，分别取出A1,B2管(1.5ml离心管)作一下步骤:TOC\o"1-5"\h\z去离子双蒸无菌水 15mlLodingbuffer 2M质粒 2MEcoRl酶 1M在37°C的水浴中过夜。琼脂糖凝胶电泳制作0.9%的琼脂糖凝胶：称取0.9g的琼脂糖，放入三角瓶中，再加100ml0.5*TBE(Tris-硼酸-EDTA)电泳缓冲液。在微波炉中加热使琼脂糖溶解，(液体比要超过三角瓶容积的一半，以1/3较好)用滤纸塞于瓶口，留出缝隙，以防瓶盖在加热时被蒸汽冲开。制胶模具的两端用医用橡皮膏封好，再其边缘加上少量琼脂糖溶液，凝固后有防泄露作用。将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度一般为0.5cm。迅速在模具一端安插上梳子，检查有无气泡。室温下30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固(低熔点凝胶应于4C凝固)，小心取出梳子，并撤除模具两端的橡皮膏，将凝胶放置于电泳槽中准备电泳。琼脂糖凝胶电泳：将提前制作好的0.9%琼脂糖凝胶块置入电泳槽内(琼脂糖凝胶浓度与线形DNA分辨范围，如表2-2)，并向电泳槽内注入电泳缓冲液，缓冲液的高度应覆盖过胶面1cm左右。将mlLodingbuffer加入到2闫样品溶液中混合，然后用微量注射器注入样品槽中。在最后一个样品槽中加入DNAMarker，作为对比。连接电极、设定合适的电压(120V44mA)及转换时间，并开始电泳，同时观察染料到到琼脂糖凝胶的2/3时断电，停止电泳。电泳结束后，取出琼脂糖板，将其放入含EB的水溶液中着色10min，放入紫外线检测仪，观察结果。DNA浓度与OD值的测定：实验步骤如下：打开紫外分光光度计预热10min。在一个比色杯中加入蒸馏水，体积超过比色杯的2/3作为对照，放入样品槽，仪器调零。吸取5MDNA样品，置于另一比色杯中，加入2985ml蒸馏水(DNA浓度被稀释600倍)，打匀，放入另一样品槽。在260nm和280nm分别读出样品光密度值。2结果和分析2.1结果2.1.1DNA溶液的OD值表1.样品OD值结果表浓度OD值方法 OD(260nm) OD(280nm)(Pg/Pl)(260/280)A 0.102 0.096 3.0601A 0.105 0.111 3.1502A 0.079 0.092 2.3703B 0.013 0.012 0.3901B 0.014 0.013 0.4202B 0.020 0.018 0.60031.5831.5751.7351.6141.6051.656样品浓度(P-l/ml)=OD(260nm)值X50gg/1OOOmX600倍。数据的统计学检验：在统计学上，把小概率事件在一次实验中看作是实际上不可能发生的事件，称为小概率事件不可能原理_ S「+S22X1-X2 口_ X"X2SX1-X2Df= (n1-1)+(n2-1)=4注：N为样本数X1为碱法OD值平均数X2为试剂盒法OD值平均数S：为碱法均方S22为试剂盒法均方sX1-x2为均数差异标准误经统计学计算t=0.111，|t|<t005⑹，则P>0.05即差异不显著，可以认为两组数值无差别

2.2.2琼脂糖凝胶电泳结果D1J2M图1.经过酶切质粒DNA的电泳图D1为碱法J2为试剂盒法M为DNAMarkerD1D2D3J2J2为试剂盒法2.2.分析:（1） 通过表1可见，试剂盒法B、B、B的OD值在1.6〜1.8之间，说明试剂盒提1 2 3取DNA的纯度高，但DNA的浓度低，提取质粒DNA的量较少。碱法A「％的OD值小于1.6，纯度不高，但DNA的浓度高，提取质粒DNA的量比试剂盒法多。（2） 通过图1与图2可以观察出，RNA去除的比较好。碱法与试剂盒法的电泳结果几乎没有区别，但从DNA的浓度来讲，碱法的要好于试剂盒法的，不知是什么原因浓度对电泳结果没有影响，使得电泳结果几乎没有区别，还需进一步研究。通过统计学计算分析，这俩种方法没有显著差异，鉴于试剂盒法价格比较昂贵，不适合大批量实验，而碱法价格低廉，适合实验室使用，具有较强的实用性。3讨论3.1质粒概述细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。质粒是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。通过细菌间的接合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，是分子克隆常用的载体之一。质粒DNA制备是进行分子克隆的第一步。因此分离纯化质粒DNA，在遗传工程和质粒的分子遗传学研究中是重要的一环。质粒DNA能够携带外源基因进入细菌进行扩增或表达外源基因，作为基因的运载工具，在DNA重组技术，DNA测序，转基因等方面具有广泛的应用价值，因而质粒DNA的分离与提取是实验室内最常用的实验技术。1946年，Lederburg和Tatum发现的F因子是最早发现的质粒，因为F因子与高等生物细胞质中的染色体外遗传单位极为相似，1952年，由Lederburg正式命名为质粒。确切的说，质粒是细菌内共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要的媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。3.2质粒提取的主要步骤：已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长；细菌的收获和裂解；质粒DNA的纯化。3.2.1细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体（如PBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像PBR322-类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素Mg/ml）B成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。3.2.2细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。（1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。⑵可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。（3）目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。3.2.3质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯一漠化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于漠化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。漠化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了漠化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个漠化乙锭分子）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量漠化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯一漠化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。另外，现在已可买到现成的纯化KIT。3.3制备质粒DNA时选择方法应考虑的因素：3.3.1菌株类型大量提取HB101、TG1菌株中的质粒，不提倡选择煮沸法，这类细菌富含丰富糖类，在煮沸或去污剂裂解细菌时，大量释放出来。若用CsCl-EB梯度平衡超速离心，糖类的密度平衡区域与闭环共价质粒DNA带非常邻近，在抽取闭环质粒DNAS时，不可避免地污染有糖类，它们可抑制许多DNA限制性内切酶的活性。另外，HB101及其它含有endA+基因型的菌株表达种的核酸内切酶A，在煮沸时不能外全失活，在以后的操作中，只要有Mg+存在（如内切酶反应缓冲液），核酸内切酶A就可将质粒DNA降解，而影响实验结果。若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒DNA，不管是大量还是小量制备，必须用酚、氯仿反复抽提几次。以去除该酶。3.3.2质粒的大小大于15kb的质粒DNA易被强烈的物理或者化学作用损坏，所以常选用操作过程较温和的SDS法，细菌悬浮液中含有10%的蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力，在溶液消化细菌壁与膜后，再加SDS解聚蛋白质与DNA的结合，整个操作中物理剪切力小，使用与大分子量的质粒DNA的提取。3.3.3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制碱法是目前实验室中常用的质粒DNA提取方法。它对细菌的裂解，细菌染色体DNA及蛋白质变形充分，所以提取的质粒DNA产量高，纯度好。但是暴露在强碱性环境中时间过长，共价闭合环状质粒DNA可发生不可逆的变性，导致内切酶切割困难，质粒DNA迁移速度降低1倍左右，EB染色效率低。1966年Vinograd等人对这个问题作过报道，但目前，仍有些试验人员，对这一关键问题并没有足够的重视。我们也曾在琼脂糖凝胶电泳时见到这种着色浅的DNA形式，若出现这种状况，在下次提取时，可以适当缩短碱变性时间，不必按某些书籍中规定的10分钟时间操作。在煮沸法中，过长时间、过高热度也会导致类似问题的出现，这种影响试验结果的操作细节应根据具体的菌株和质粒情况加以适当改进。3.3.4细菌的培养与收集细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，也会影响到质粒的质量和内切酶酶解效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用STE或生理盐水再次悬浮、漂洗菌体1-2次。早一代质粒如pBR322，在细菌中的拷贝数并不多，需要用氯霉素选择性地抑制细菌的蛋白合成和细菌分裂，有利于质粒的进一步扩增。这种选择性扩增，一般持续十几小时。对于新一代质粒，如pUC、pGEM系列质粒，在细菌中扩增拷贝数很多，这种选择性扩增，显得不太必要。况且长时间在氯霉素存在下，质粒DNA合成过程中，复制链中会产如核糖核苷酸，对碱性条件敏感，将会导致大量的缺口环状DNA和线性质粒的产生。即使在使用新型质粒的情况下，有些人仍然偏爱用氯霉素选择性扩增质粒，其理由是在中等体积培养物中能获取与大量培养物等同的质粒产量。而且细菌量的减少，使得裂解物的复杂性和粘稠度降低，操作更方便、有效，对煮沸法更是如此。所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量。3.4核酸的定量：组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250-270nm之间，例如腺嘌吟的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶为267nm，鸟嘌吟为267nm等。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但是核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡聚核苷酸为20ug/ml，可以此来计算核酸的样品浓度。分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8,RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质有含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。对于很稀的核酸溶液，核酸的另一物理特性提供了另一方法，那就是用荧光光度法。DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料漠乙锭(ethidiumbromide，EB）嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外线照射激发下，可以发出红色荧光，其荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液做标准对照，可比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1-5ng。此法的比较是基于目测，所以是估计水平。另外在比较时，应该考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。荧光分光光度法测定核酸浓度不但能测定浓度小于0.25ug/ml的核酸样品，也可以用于了解核酸样品中严重污染干扰核酸紫外线吸收物质的情形。此法核酸用量小，可迅速判定结果。它包括塑料薄膜法、琼脂糖平板法（为了避免DNA样品中含有增强或猝灭荧光的污染物干扰，可采用此法）、微型凝胶电泳法（若DNA样品中含RNA或其他杂质，此法是一种方便而准确的定量方法，荧光法灵敏度快速。但它的荧光强度决定于漠乙锭嵌入碱基中的多少，这与DNA的超螺旋程度密切相关，标准品与样品难以完全一致，并且还受其他影响荧光发光污染物的影响，所以对该方法褒贬不一，但是在一些基因克隆中，DNA样品非常珍贵的情况下，仍不失为一种行之有效的定量方法。3.5关于酶切的讨论DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用。为了实现DNA的体外重组，选择合适的限制性内切酶，对载体及供体质粒进行酶切，从实验结果看出：EcoRI酶切完全。此酶的识别顺序为GAATTC，对P15质粒切割效果很好。使用过程中应注意：（1） 酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。（2） 进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱。3.6试剂的使用用离心法的植被过程中，选用了NaAc来沉淀DNA，NaAc应使用前临时配制，而且要使其PH值达到要求（PH6），在DNA、RNA提取与纯化实验中大多数都采用NaAc。NaAc有易于与DNA共沉淀，在碱法试验时，曾试不加NaAc，使结果不明显，甚至有的离心管没有沉淀。因此，试验时加入NaAc是十分必要的。3.7关于电泳的讨论3.7.1电泳的概述电泳即电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳（electrophresis,EP）。早在1808年就发现电泳现象，但做为一种分离方法，却是在1937年。瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台自由电泳仪，建立了移界电泳法（movingboundaryEP）成功地将血清蛋白质分成白蛋白（albumin），a1-，a2-，p-和y-球蛋白（globulin）五个主要成分，为人们了解血清奠定了基础。由于他的突出贡献，1948年获得诺贝尔奖。由于“移界电泳法”电泳时自由溶液受热后发生密度变化，产生对流，使区带扰乱，加之Tiselius电泳仪价格昂贵，不利于推广，所以到了50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸，醋酸纤维生素薄膜，淀粉及琼脂糖做为支持物。影响电泳速度的外界因素：电场强度，溶液pH值，电渗现象，对支持物的选择，温度对电泳的影响。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取出来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固变会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下变会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2〜50kb之间；而要分辨较小分子量的DNA片段，则要用聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。在凝胶电泳中，加入漠乙锭（ethidiumbromide,简称EtBr）燃料对核酸分子染色之后，将电泳标本放置在紫外光下观察，变可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA，也可以被清晰的显现出来。着是因为漠乙锭是一种具有扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。当把含有DNA分子的凝胶浸泡在漠乙锭的溶液中，或是将漠乙锭直接加到DNA的凝胶介质中，此种染料便会在一切可能的部位同DNA分子结合，然而却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合，因此在紫外光的照射下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。在包含有数种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。换言之，在一定程度上，电泳谱带的荧光强度是同DNA片段的大小成正比的。这是漠乙锭-凝胶电泳体系的一种重要的特性。据此，研究工作者门变能够通过用已知分子量的标准DNA片段之间的笔记哦袄，测定出共迁移的DNA片段的分子量，并对经核酸内切限制酶局部消化产生的DNS片段作出坚定。琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料漠化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加°DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离漠化乙锭时即可以检测到少量的DNA。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移°DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。凝胶电泳是研究核酸、蛋白质的生物大分子的一项重要技术，也是DNA的限制性内切酶切割片段的分析、分离、醇化的一种不可缺少的方法。［16］自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分步分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。同时也是现在通用的许多分子生物学研究方法，因此倍受科学工作者的关注。3.7.2基本原理在生理条件下核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是成离子化状态的。从这种意义上讲，DNA和RNA的多苷酸链可叫做多聚阴离子（polyanions）。因此，当核酸分子被放置在电场中时，他们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或RNA分子要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。3.7.3Lodingbuffer的作用Lodingbuffer中含有0.25%漠酚蓝、30%甘油、40%（W/V）蔗糖等，混合在样品中的甘油可增加样品液的比重，因此样品可以自然平铺于样品槽中，并且不易扩散，由于漠酚蓝染料的存在，可直接观察到加样的情况，而且染料在电泳过程中可作为指示标志。3.8影响DNA电泳迁移率的因素影响DNA电泳迁移率的因素很多，主要有以下几个方面，DNA分子大小、DNA构象、使用电压、基质成分、电泳缓冲液和DNA加样量等。在DNA电泳实验中，主要的决定因素是使用电压和DNA加样量。在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比，但当电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的;因此，琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。加样过量导致拖尾、条带成片和迁移率降低，这些影响在约10kb长的DNA片段特别明显，样品中的NaCl浓度几乎无影响。3.9DNA分离纯化的原则分离纯化DNA的总原则是：首先应保证DNA一级结构的完整性；其次应排除其他分子的污染。为了保证DNA结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之内，DNA的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。对于DNA的纯化应达到以下三点要求:①DNA样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其他生物大分子如蛋白质、多糖和酶类分子的污染应降低到最低程度；③排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。为可保证分离DNA的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有还因素对DNA的破坏；②减少化学因素对DNA的降解，操作多在PH4〜10条件下进行；③减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要是机械剪切刀，其次是高温。机械剪切刀包括强高速的溶液震荡、搅拌，DNA样品的反复冻贮，这些操作细节在实验操作中应备加注意。④防止DNA的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核算链中的磷酸二酯键，直接破坏DNA的一级结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+,Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、柠檬酸盐，基本上可以一直DNA酶的活性。在实验应用中，某些因素对DNA的提取至关重要。在DNA提取过程中，用酒精进行沉淀，DNA在酒精中可保存较长时间，这说明酒精对DNA没有或仅有较弱的降解作用。此外，在DNA释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管，若必须移管时应选用大口吸管，一避免人为的DNA剪切。纯化DNA用TE缓冲液(PH8.0)溶解，置4°C保存即可，若短时间不用应在-20C冻贮，切忌反复冻融，以免DNA降解。3.10试剂盒法与碱法的比较讨论3.10.1试剂盒法原理：本试剂盒采用SDS/NaOH溶菌方法裂解细菌。独特的中和方法选择性地将质粒DNA释放到溶菌液上清中，基因组DNA则在中和过程中与蛋白质一起形成不溶性复合物。离心去除基因组DNA与蛋白质不溶性凝结块后，上清中的质粒DNA选择性地结合到silica膜上。经BufferW「BufferW2洗涤清除残留在silica膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到silica膜上的质粒DNA分子经为量水或Eluent洗脱下来，即可用与各种分子生物学实验。采用传统的SDS/NaOH溶菌方法裂解细菌，结合silica膜选择性吸附DNA的原理，适合从1~4mlLB细菌培养物中提取至20Pg高纯度质粒、Cosmid或M^3复制型DNA，也适用于提取BAC、PAC和P】等大型质粒DNA。试剂盒整个纯化过程仅需20〜30min，不涉及毒性有机溶剂的使用，也无需超速离心、乙醇或异丙醇沉淀。可以大大的节约实验时间，避免由于时间过长导致的实验误差。经过纯化的质粒DNA适合用作测序、酶修饰、体外转录与翻译、细菌转化等分子生物学实验。3.10.2碱法提取DNA原理：在PH12.0〜12.6碱性环境中，线形的大分子量的细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间脚联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可将去除大部分细胞碎片染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，在用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。3.10.3碱法与试剂盒法的比较：碱法是实验室常用方法，适用于小质粒DNA的提取，只是需要时间较长，而且从检测结果中可以看出，碱法提取的DNA纯度没有试剂盒法高，但提取质粒DNA的量比较多，加上其价格低廉，适用于实验室研究。试剂盒法虽然简单、快捷，DNA纯度好，但试剂盒价格昂贵且反应次数少，而且DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，不适合用于一般实验室使用。通过统计学计算分析，这俩种方法没有显著性差异，所以碱法具有较强的实用性。参考文献SatoYS,IsuchiyaB.etal.ComparisonoftheDNAextractionmethodsforpolymemgechainreactionamplificationfromfomalin-fisedandparaffin-embedded[J]tiasnes.DiagnMolPatbolL,2001,10(4):265〜271⑵MichieliP,ChedidM,LinD,etal.InductionofWAF1/CIP1byp53-independentpathway.CancerResearch,1994,54:3391〜3395苏应斌、戴天力,改进的PCR模板制备及DNA回收方法，湖北医科大学学报.1997.18(1):24~25PolyakK,KatoTY,SolomonMJ,etal.p27Kip1,acyclin-Cdkinhib