细胞化学元素

第第页细胞化学元素(合集7篇)

时间：2023-06-2916:41:37

细胞化学元素第7篇

[关键词]骨髓间充质干细胞体外诱导视网膜神经样细胞

胚胎干细胞具有发育全能性，理论上可诱导分化为机体所需的任何组织或器官，但涉及伦理学问题，以往受到很大限制，发展缓慢。应用眼色素上皮缘的视网膜干细胞[1]及鼠脑神经先祖细胞移植[2]也由于供体组织有限性及安全性问题，不利于治疗视网膜疾病的开展。于是有人把目光投向成体干细胞中的MSCs，成年动物骨髓有2类干细胞群：造血干细胞和间充质干细胞。最初因其容易贴壁呈成纤维细胞样克隆生长，被称为成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）[3],后来研究发现它是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具支持和调控造血的作用，且具有多向分化潜能，故又称其为间充质干细胞[4]。也称为骨髓基质细胞[5]。

MSCs的特点为:①来源于中胚层，可以跨系统甚至跨胚层分化为3个胚层来源的细胞，特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞（视网膜来源于胚胎期神经外胚层），并且经过20~30次细胞分裂后，这种分化特性也不会消失[6]。②分离培养方便。③由于不表达T细胞识别的细胞表面标志，植入后不会发生免疫排斥反应。④易于转染和稳定高效表达外源基因优点[7],因此可把利于定向分化的生长因子基因转入MSCs，促使其定向分化。

MSC的纯化方法有贴壁筛选法，流式细胞仪分选法，密度梯度离心法，免疫磁珠法。如果能找到更特异性标记物，就可以获得更纯的MSCs，这对后续的实验步骤所得的实验数据有重要影响。

MSC为中胚层来源的干细胞，难于使其直接定向分化为外胚层来源的视网膜神经细胞[8]，而且MSC直接移植后只有少量细胞能分化为视网膜神经细胞，因此要通过MSC获得神经干细胞，再分化为神经前体细胞，进一步分化为成熟的神经细胞。Nestin抗体（巢蛋白）为神经干细胞的特异性抗体，而MAP-2抗体为成熟神经元特异性标志。

MSC表达许多生长因子和细胞因子受体以及细胞与细胞黏附作用的受体，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循环的调控。这成为不同方法诱导MSCs定向分化的理论基础。目前，体外诱导MSCs向神经样细胞分化有4种方法：生长因子诱导，抗氧化剂诱导，中药诱导，增加MSCs内cAMP诱导。

1生长因子诱导方法

Sanchez-Ramos等[9]将BMSC（Bonemarrowstromalcells）用10ng/mLEGF预诱导，再用脑源性神经生长因子（BDNF）诱导，见其表达巢蛋白（nestin）。同时也表达GFAP和NeuN.当将人或鼠的BMSCs与小鼠的中脑细胞或纹状体细胞共培养，结果有很小比例（0.2%~5%）MSCs表达神经胶质细胞标记物-神经胶质元纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）和神经元标记物-神经元特异白(Neuron-specificnuclearprotein,NeuN)。这种方法常用于诱导分化为视网膜神经样细胞的研究。

张卉以含有碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）或表皮生长因子(EGF)加bFGF，或bFGF、EGF加全反式维甲酸(ATRA)的培养液培养BMSCs,经诱导物诱导72h后,纤维连接蛋白（fibronectin）和I型胶原（collagenI）免疫阳性细胞减少。转化为神经干细胞（NSC）的nestin免疫阳性细胞增多。7d后其又减少。细胞分化后,分化为神经元（神经元特异烯醇化酶-NSE）的阳性细胞最多占细胞总数的24.76%±2.72%,同时分化为神经胶质细胞的GFAP阳性细胞占细胞总数的36.58%±3.26%[10]。bFGF参与骨髓MSC向神经分化的启动[11]，同时bFGF又可促使神经前体细胞对EGF产生反应，两者联用有明显的协同作用，发挥增殖效应[12]。从胚胎发育的过程来看，EGF及其受体出现要比bFGF晚，研究表明EGF多促进MSCs向胶质前体细胞分化，而bFGF主要对神经元前体细胞的分化有促进作用[13，14]。

有人在MSC培养基中加入神经胶质生长因子（glialgrowthfactor,GGF）,观察其可以向神经胶质细胞分化，并表达GFAP。

Anthony等应用activinA（活化蛋白A），牛磺酸和EGF对成人CD90+MSCs体外诱导分化后，20%~32%的细胞表达感光细胞特异标志――视紫红质，视蛋白，recoverin(恢复蛋白)[8]。受此实验启发，可知在不同的化学诱导条件下，MSCs可能分化为不同类型的视网膜细胞。

孙旭芳等[15]用DMEM/F12(含10%FCS胎牛血清和100u/mLP/S)1:1添加0.6%葡萄糖，1×ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒化物，insulintransferringselenium）,2mM谷酰胺，3mM碳酸氢钠，20ng/mLEGF,20ng/mLbFGF,5mMHepes制成分化液Ⅰ诱导6~10代rMSC14天后，检测其高表达神经干细胞特异性标志物nestin。培养视网膜神经细胞,收集视网膜细胞培养上清液加入10%的FCS,与视网膜神经细胞培养液按照1:1混合，制成分化液Ⅱ，使形成的神经球形体在模拟眼内环境诱导下分化出视网膜神经样细胞，48h用免疫荧光检测，部分细胞NeuN,Thy1.1染色阳性（Thy-1位于哺乳动物RGCs.Thy-1.1抗原仅表达在大鼠神经节细胞上，用于鉴定大鼠RGCs），少数细胞表达GFAP。

牟大鹏等[16]先把分离到的视网膜组织加入DMEM培养液并用阿糖胞苷（Ara-C以抑制非神经细胞的增殖后）处理后，将视网膜神经细胞培养液的上清液收集于干净玻璃瓶中，真空抽滤后按2:3比例与DMEM培养液混合后诱导分化2~4代的rMSCs,2d后即可见神经元样细胞出现，7d神经元样细胞占细胞总数的26~27%，免疫荧光检测βtubulinⅢ（又称微管蛋白是RGCs早期和成熟期的标志物）阳性为18%±3%，Neurofilamentprotein(NF，神经丝蛋白，是神经元的特异性标志物)阳性率为23%±4%，3天后免疫组化Nestin阳性数为30.9%±7.7%，MAP-2染色阳性。

在视网膜神经细胞上清液制成的微环境中，视网膜神经细胞产生的细胞外基质如各种糖蛋白，粘蛋白，各种神经营养因子，各种细胞因子等可以维持骨髓源性神经干细胞生存，并向特定的视网膜细胞分化的良好环境。

bFGF诱导方法是诱导BMSCs向神经元方向分化的经典方法[17]，其优点在于可以获得较多的神经元样细胞。刘东宁等[18]先用含10ng/mLbFGF的DMEM/F12(10%FBS)预诱导24h,再加入DMEM/F12,10ng/mLbFGF,2%二甲基亚砜，200umol/L丁羟茴醚，10umol/L福斯高林，5mmol/LKCl,2mmol/L丙戊酸，5ug/mL胰岛素的神经诱导基诱导第3代BMSCs7天。免疫化学鉴定1~7d可见神经元样细胞MAP-2(抗微丝微管相关蛋白-2)74.2%，Thy1.1阳性，GFAP阴性。也说明bFGF诱导后细胞主要向成熟神经元方向分化，而不是神经胶质细胞。bFGF诱导虽然可以获得较多的成熟神经元，但难以长期存活，联合其他神经营养因子如脑源性神经生长因子进行维持培养，有利于诱导后神经元的长期存活。

BMSCs与新生鼠视网膜神经细胞共培养后可分化为RGCs(retinalganglioncells,视网膜神经节细胞)特异性抗体Thy1.1表达阳性的细胞[19]。利用出生1~3d的乳鼠视网膜细胞作为诱导剂置于Transwell双层培养板的上层使未成熟的视网膜组织内促进原始视网膜干细胞分化和发育的细胞因子，受体(BDNF,NGF,TrkB受体等)及细胞外基质成分，通过上层滤膜孔扩散至下层BMCs周围，模拟了原始视网膜发育的微环境。本实验说明BMSCs经化学性诱导和视网膜神经细胞共培养诱导均可特异性分化为具有RGCs表型的细胞。

一些体外实验还证实，还有许多因子调节MSC的分化方向，如胰岛素样生长因子Ⅰ(insulinlikegrowthfactorⅠ,IGFⅠ)和脑源性生长因子(brain-derivedgrowthfactor,BDGF)被证实支持神经元方向分化。而睫状神经营养因子（ciliaryneurotrophlicfactor,CNF）和白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor,LIF）作用于多潜能MSC,诱导它们分化成星形胶质细胞.

2抗氧化剂诱导

活性氧(ROS)是氧分子还原成水时产生的许多活性中间体的统称,包括过氧化氢(H2O2/超氧阴离子(O2ˉ)/羟自由基(OH)等。有学者证实[20]抗氧化剂可上调细胞P53基因转录表达的同时可下调c-myc基因的表达，从而调控细胞周期诱导干细胞分化。

Woodbury等[21]报道,将鼠和成年人的MSCs先用2-巯基乙醇（ME-2）的DMEM/FBS诱导，以启动MSCs的神经细胞分化，接近80%出现神经细胞的表型和表达神经细胞标志性蛋白NSE（神经元特异性烯醇化酶）,NF-M（神经丝蛋白）,NeuN（神经元特异性核内抗原）。进一步用二甲亚砜，丁羟基苯甲醚，叔丁基对甲氧酚的DMEM中诱导，一周内超过50%的MSCs出现神经细胞形态学的改变，且以神经元标记物NSE，M-神经丝或Tau增高为主。

项鹏等[22]分别采用含巯基乙醇和硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元，结果示诱导24小时,MSCs中约75.5%的NSE阳性而GFAP阴性。贾延等[23]在β-巯基乙醇预诱导MSCs24h,再诱导5h,NSE表达率为(63.7±4.5)%。

3中药诱导

肖庆忠等[24]采用含100~150mg/L麝香多肽的无血清L-DMEM培养基诱导成年大鼠和人BMMSCs分化为神经元，免疫组化显示神经元样细胞NSE（93.5%）,NF（88.2%）,nestin表达阳性，GFAP阴性。

项鹏等[25]分别采用含丹参注射液或硫代甘油等试剂的无血清达乐伯克改良必需基本培养基(DMEM)诱导MSC分化为神经元。与传统的诱导分化剂硫代甘油相似，但细胞存活时间较久。

撒亚莲[26]用三七总皂甙和贾延等用黄荃甙诱导MSCs,均得到同样的结果。此外,黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆多种传统中药成分及中药制剂体外均能诱导大鼠分化为神经元样细胞[27]。

4增加MSCs内cAMP诱导其分化

可从基因水平上，诱导MSCs沿着特定的路径增殖发育成各种神经细胞。

Dengweiwen等[28]发现未分化的hMSCs可表达一些神经细胞的标志物，如微管蛋白(TuJ-1，neuron-specifictubulin),神经元特异性烯醇酶（NSE），微管相关蛋白(MAP1B，microtubule-associatedprotein1B)及波形蛋白(vimentin)。在培养基内加入诱导剂0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IMBX，isobutylmethylxanthine)和1mMcAMP类似物双丁酰环磷腺苷(dbcAMP，dibutyrylcyclicAMP)，诱导6天,约有25%的MSCs分化为典型的神经细胞形态,NSE和vimentin表达增高,且这种分化是不可逆的。提示：在体外，通过增加细胞内cAMP水平，可使MSCs分化为早期的神经前体细胞。

项鹏、夏文杰等[29]采用含腺苷酸环化酶激动剂Forskolin及磷脂酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。

5几种诱导因素的比较

对以上几种诱导因素综合比较可用增加胞内cAMP使MSCs分化为神经前体细胞，用抗氧化剂诱导MSCs分化为神经细胞，用生长因子诱导途径分化为神经胶质细胞或神经元细胞。此外应用中药诱导也不失为一种可行方法。虽然后三种方法还未应用于诱导MSCs分化为视网膜神经样细胞，但却展示了其良好的发展前景。

6问题与展望

不仅是不同诱导途径的差别，在MSCs培养，MSCs表面标志的检测，视网膜神经细胞的培养，MSCs向视网膜神经样细胞的分化，每一个环节都会影响免疫组化和RT-PCR监测到的阳性率。影响