五门配套课件药分chape 15 xu

第十五章甾体激素类药物的分析Analysis

of

Steroid

Hormones甾体激素

是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质，具有极重要的医药价值–在维持生命、调节性功能、对机体发育、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用最早被发现的甾体激素天然雌激素–雌二醇（Estradiol）–雌酮（Estrone）–雌三醇（Estriol）1、熟悉本类药物的分类，掌握其结构特征与分析方法的关系2、掌握红外光谱鉴别法及某些官能团的呈色反应，了解其他鉴别方法3、掌握本类药物中其他甾体的检查方法，了解其他特殊杂质的检查4、掌握四氮唑比色法、异烟肼比色法的原理、方法及测定条件。5、了解UV法、Kober反应比色法及HPLC法在其含量测定中的应用教学要求主要内容⊙分类与结构特点⊙鉴别⊙检查⊙含量测定第一节

基本结构与分类天然和人工合成品的甾体激素，均具有环戊烷并多氢菲母核。CD2351A

B4

68791011C131415161712

181920C21

按照药理作用分类甾体激素类药物肾上腺皮质激素雄性激素及蛋白同化激素性激素孕激素雌激素以下主要基团可供分析：1.Δ4-3-酮，C20酮基2.C11：

或COCOH2O3.C17：

COOC

CHCH

OH

，

COH

，

OCR，CH3

，A环上的酚羟基卤素(-F)，酯基结构分析CCD231A45687910B11C131415161712

18192021

结构特点A环，多为脂环，且C4/C5间有双键，并与C3酮基共轭，称为α，β-不饱和酮，标记为Δ4-3-酮；少数为苯环；

C3，可能有酮基或羟基；C10、C13，多数为角甲基，少数C10无角甲基；C11，可能有酮基或羟基；C17，可能有羟基、酮基、甲酮基、α-醇酮基、甲基、乙炔基等；人工合成的甾体激素，有些在C6或C9上引入卤素，C16上引入甲基、羟基，以及具有C1/C2双键等。1肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素（Adrenocortical

Hormones)肾上腺皮质以类固醇为原料，合成和分泌的激素的总称。结构特点：有21个C原子；A环，具有Δ4-3-酮；C17，

有α-醇酮基，并多数为α-羟基；C10、C13，有角甲基；

C11，有羟基或酮基；其它，有些皮质激素具有Δ1，6α、9α卤素，16α羟基，6α、12α、16α、16β甲基等。OHOOHHHH肾上腺皮质激素氢化可的松△4

-3-酮基C17

–α–醇酮基O

CH2OH本品为糖皮质激素，具有抗炎及免疫抑制作用，抗毒作用和抗休克作用OHOOHFHCH3OOOHCH3H醋酸地塞米松Dexamethasone

acetate△1,4-3-酮基C17–

α

–

醇酮基肾上腺皮质激素类药。本品具有抗炎、抗过敏作用，能抑制结缔组织的增生，降低毛细血管壁和细胞膜的通透性，

减少炎性渗出量，抑制组胺及其他毒性物质的形成和释放。肾上腺皮质激素主要活性基团性

质△4

–3–酮C17

–α–醇酮基UV、与羰基试剂反应还原性2雄性激素及蛋白同化激素临床常用睾酮的衍生物，如甲睾酮、丙酸睾酮、十一酸睾酮等；蛋白同化激素有苯丙酸诺龙。结构特点：雄性激素母核具有19个C原子；蛋白同化激素母核具有18个C原子（C10上无角甲基）；A环，具有Δ4-3-酮；C17，无侧链，多数是一个β-羟基，有些是它形成的酯，有些具有α-甲基。雄性激素及蛋白同化激素主要活性基团△4

–3–酮性

质UV、与羰基试剂反应C17

–β–羟基可成酯OOHHHHOCH3雄性激素丙酸睾酮OHHOOHH蛋白同化激素苯丙酸诺龙雄性激素具有雄性活性和蛋白同化活性。蛋白同化激素–化学结构修饰的结果得到一些雄性活性很微，而蛋白同化活性增强的新化合物知识点介绍生物最重要和基本的特征在于生物进行新陈代谢。所有生物一定会具备合成代谢(同化作用)以及分解代谢(异化作用)。这是互相对

立的两个方面，是生命现象的基础。生物体从外界环境中吸取物质,并把它们转变成为自身的组成物质的过程,称为同化作用.同化作用是新陈代谢当中的一个重要过程，作用是把消化后的营养重新组合，形成有机物和贮存能量的过程。异化作用就是生物的分解代谢。是生物体将体内的大分子转化为小分子并释放出能量的过程。呼吸作用是异化作用中重要的过程。蛋白同化制剂指，所有的合成雄性激素类固醇都有与睾酮相似的化学结构。这类药物除具有增加肌肉块头和力量，并在主动或被动减体重时保持肌肉体积的作用外，还具有雄激素的作用。此外，还可加快训练后的恢复，有助于增加训练强度和时间。但是，如果不同时进行系统的力量训练，服用这类药物就没有增长肌肉的作用。同化激素临床应用雄性激素虽有较强的同化作用，但用于女性或非性腺功能不全的男性，常可出现雄激素作用，从而限制了它的临床应用；因此，合成了同化作用较好，而雄激素样作用较弱的睾酮的衍生物，即同化激素（anabolic

steroids），如南诺龙（苯丙酸诺龙，nandrolone

phenylpropionate）、司坦唑（stanozolol，康力龙）及美雄酮（methandienone，去氢甲基睾丸素）等。本类药物主要用于蛋白质同化或吸收不足，以及蛋白质分解亢进或损失过多等情况；如严重烧伤、手术后慢性消耗性疾病、老年骨质疏松和肿瘤恶液质等病人。服用时应同时增加食物中的蛋白质成分。是体育竞赛的一类违禁药。长期应用可引起水钠潴留及女性轻微男性化现象。有时引起肝内毛细胆管胆汁郁积而发生黄疸。肾炎、心力衰竭和肝功能不良者慎用，孕妇及前列腺癌病人禁用。3

孕激素也称黄体酮或孕酮，典型药物为黄体酮。中国药典有：黄体酮、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、醋酸甲地孕酮原料及制剂；醋酸氯地孕酮原料等。结构特点：有21个C原子；A环，具有Δ4-3-酮，C17，有甲酮基，有些具有α-羟基，与醋酸、己酸等形成酯（如：醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、己酸羟孕酮等）；其它，有些具有Δ6，6β-甲基、6α-甲基、6β-氯。孕激素主要活性基团△4

–3–酮C17

–甲酮基

C17

–乙炔基性

质UV、与羰基试剂反应与亚硝基铁氰化钠反应与AgNO3反应OHHHCH3C

O孕激素黄体酮4雌激素又称卵泡激素：雌二醇、炔雌醚原料，苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇、炔雌醇原料及制剂等。结构特点：具有18个C原子；A环，为苯环；C3有酚羟基，有些形成酯或醚；C10，无角甲基；C17，有β-羟基或酮基，有些羟基形成了酯，有些具有乙炔基。中国药典05版收载口服避孕药物：炔诺酮、炔诺孕酮、炔孕酮等，多数在A环上具有Δ4-3-酮，于黄体酮和睾酮一致；有的在C17上具有β-羟基、α-乙炔基或甲酮基；有的在C10上无角甲基，与雌激素相同。雌激素主要活性基团A环为3–OH

苯环C17

–乙炔基

C17

–羟基性

质UV、与重氮苯磺酸盐反应与AgNO3反应可成酯HOHHC

CHOHH雌激素炔雌醇OH雌二醇OHHOA环为苯环，C3：羟基第二节鉴别化学鉴别法物理常数的确定(熔点、比旋度、吸光系数)与强酸的呈色反应官能团的反应制备衍生物测定熔点

UVIRTLCHPLC熔点中国药典中的地塞米松的性状下规定本品熔点为128～

131℃比旋度具有不对称结构的物质具有旋光性。当偏振光透过1dm，样品浓度为1g/ml的溶液，在一定波长和温度下测得的旋光度称为比旋度。如氢化可的松比旋度项下规定：取本品，精密称定，加无水乙醇溶解，并定量稀释至10mg/ml，测定比旋度应为+162°～+169

°吸收系数甾体激素类药物具有紫外吸收，最大吸收波长和吸收系数可以反应药物的紫外吸收特征，具有鉴别意义。二、化学鉴别法甾体激素类药物呈色H2SO4HClO4H3PO4HCl（一）与强酸的呈色反应（母核）与硫酸显色反应显

色荧光 加水稀释泼尼松龙

深红絮状↓灰泼尼松橙↓红色黄→蓝绿炔雌醇炔雌醚橙红 黄绿橙红 黄绿絮状↓玫红醋酸可的松

黄或微带橙褪色并澄清官能团的反应肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐OHˉ还原性1 C17

–α–醇酮基呈色反应用于鉴别和含量测定等醋酸泼尼松的鉴别（ChP2010）取本品约1mg，加乙醇2ml使溶解，加10％氢氧化钠溶液2滴与氯化三苯四氮唑试液1ml，即显红色。肾上腺皮质激素药物Cu2O↓橙红色碱性酒石酸铜B.

沉淀反应Ag↓黑色氨制硝酸银醋酸地塞米松的鉴别取本品约10mg，加甲醇1ml，微温溶解后，加热的碱性酒石酸铜试液1ml，即生成红色沉淀。甾酮类激素药物呈色羰基试剂2. C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基试剂：2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼OOHCONHNH2NHClO

HC

O

N

H

NN异烟腙（黄色）睾酮OCH3C

OCONHNH22NHCl黄体酮C

O

N

H

NC

H

3C N

H

N

O

CNN异烟双腙（黄色）氢化可的松的鉴别取本品约0.1mg,加乙醇1ml溶解后，加新制的硫酸苯肼试液8ml,在70℃加热15分钟，即显黄色。具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物呈色亚硝基铁氰化钠间二硝基酚芳香醛甲酮基黄体酮蓝紫色亚硝基铁氰化钠其他甾体淡橙色不显色黄体酮的鉴别反应取本品约5mg，置小试管中，加甲醇0.2ml溶解后，加亚硝基铁氰化钠的细粉约3mg、碳酸钠及醋酸铵各约50mg，摇匀，放置10～30分钟，应显蓝紫色。灵敏和专属性好OCH3C

O黄体酮fi[Fe(CN)5

NO]2-OH-+

2

H2O4

-CH

NO

CN

5

FeOC

O蓝紫色有机氟Fˉ有机破坏有机氯4.有机卤素Clˉ硝酸—硝酸银AgCl↓呈色茜素氟蓝硝酸亚铈OO

OHOHCH2COOHCH2NCH2COOH茜素氟蓝OO

OHOCH2NCH2COOCeCH2COOFOH蓝紫色F-Ce3+雌激素类药物红色偶氮染料重氮苯磺酸5. 酚羟基（日本药局方的鉴别）银盐沉淀硝酸银6.

乙炔基含炔基的甾体激素R

C

CHAgNO3R

C

CAg↓炔雌醇的鉴别加供试品10mg+乙醇1ml溶解+AgNO3试液•生成白色沉淀炔雌醇OHC

CHHOOHC

CAgHO白AgNO3△m.p.235

~

240℃炔雌醇

苯甲酰氯

fi

苯甲酸酯

flKOHm.p.200

~

202℃黄体酮

盐酸羟胺fi

黄体酮双酮肟

fl(三)

制备衍生物测定m.p.m.p.150

~

156℃丙酸睾酮醇制KOHfi

睾丸素fl△苯丙酸诺龙盐酸氨基脲fi△缩氨基脲衍生物m.p.约180℃分解)苯丙酸诺龙的鉴别苯丙酸诺龙50mg+甲醇2ml溶解+盐酸氨基脲试液4ml→加热回流30min→水浴浓缩→放冷→滤过→沉淀洗涤（甲醇）→水洗→105℃干燥→测定熔点182℃醇制KOH

fi香RCOOC2

H5H2SO4C2H5OH（四）水解产物的反应[Ar

]-

OOCRH2SO4臭RCOOHΔD戊酸雌二醇醇制NaOH

fi

戊酸H+特臭己酸羟孕酮fi

己酸醇制OH

-DH+特臭△４-3-酮

240nm苯环

280nmC

=

C

-

C

=

OC

=

C

-

C

=

C

-

C

=

C（五）

UV法示例曲安息龙丙酸倍氯米松溶剂甲醇乙醇浓度20μg/ml20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为0.57～0.60，在239nm与263nm处的吸收度比值为2.25～2.45（六）

IR法3750～3300cm-13300～3000cm-13000～2700cm-11900～1650cm-11650～1450cm-11000～650cm-1ν-

OHn”CHnC-HnC=OnC=Cg=CH醋酸可的松OOCH2OCOCH3C

OOH结构特征：△4–3–酮、C17

–OHC20

–酮基、C11

–酮基、醋酸酯nC=Oν-

OH3420cm-亚甲基、角甲基吸收带1750cm-11232cm-11630cm-11052cm-1nC-O-C结构特征：△4–3–酮、C17

–OHC17–乙炔基炔诺酮OC C

HO

HnC=Oν-

OH1650cm-13300cm-3270cm-1ν”CHnC”C1615cm-1结构特征：酚羟基、C17

–OHC17

–乙炔基炔雌醇OHC C

HH

O3300cm-1”CH3610cm--

OH酚羟基3505cm--

OH醇羟基1615cm-1nC=C1590cm-11505cm-1苯环的骨架振动（七）

TLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别特点：简便、快捷、分离效能高方法：对照品法要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。（八）

HPLC法主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）方法：对照品法要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。鉴别试验总结与强酸反应————甾体激素（=CO）官能团反应C17

–

α

–

醇酮基（呈色反应和沉淀反应） 酮基（羰基试剂）甲酮基（亚硝基铁氰化钠、间二硝基苯和芳香醛类）酚羟基（重氮苯磺酸）炔基的沉淀反应卤素反应酯的反应制备衍生物测定熔点UVIRTLCHPLC三、杂质检查特殊杂质的来源多由结构改造来，可能带来原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂溶剂等，是一重要项目。此外，有些甾体药物还规定其他检查项目。检查项目有关物质（其他甾体）硒残留溶剂（甲醇和丙酮）游离的磷酸盐的检查（一）其他甾体（方法：具有一定分离能力）甾体激素药物多由甾体母体或结构类似的其他甾体激素制备而来，也具有一定的药理作用而又互相不相同，使其他甾体或有关物质的限度检查显得非常必要，成为甾体激素药物纯度检查的一个重要项目。TLC和HPLC为各国近版药典采用36中原料中34种采用薄层色谱法检查；10种原料已采用

HPLC法。薄层色谱法药典色谱条件薄层板：大多采用硅胶G板，少数采用硅胶

GF254或硅胶HF254。供试液和对照液的制备：取一定量供试品和对照品，分别用溶剂（如氯仿-甲醇或甲醇或氯仿或丙酮）配成一定浓度的溶液。展开剂系统：各种不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶剂用得最多；还有苯、无水乙醇、二氯甲烷-甲醇-水、氯仿-甲醇、二氯甲烷-醋酸甲酯-水、苯-丙酮等混合溶剂。显色剂：碱性四氮唑蓝试液；硫酸-乙醇（2：8或1：1或3：7）；20%硫酸；10%磷钼酸-乙醇液。5.检测法：用碱性四氮唑蓝试液作显色剂时，以展开剂展开后，晾干，显色检查显色剂和条件条件显色剂在105℃干燥

10min，放冷碱性四氮唑蓝试液，立即检视以展开剂展开后，晾干喷以硫酸-乙醇，在120℃或100℃加热5min，放冷置紫外光灯（365nm）下检视展开剂展开后，晾干喷以20%硫酸显色，在105℃加热10min后检视；以展开剂展开后，晾干喷以10%磷钼酸-乙醇液，在100℃加热

10~15min，在日光下检视某些甾体激素药物，如醋酸去氧皮质酮、地塞米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠等采用硅胶GF254薄层板，用展开剂展开后，晾干，直接在紫外灯（254nm）下检视。判定法：按各药品项下规定得杂质斑点的数目和颜色的要求进行判定。无法显示该图片。无法显示该图片。地塞米松磷酸钠中杂质检查规定：如显杂质斑点，不得多于2

个，其颜色与对照品主斑点相比较，不得更深地

塞

米

松

磷

酸

钠

地

塞

米

松20m

g

/

m

l

0

.2

0

m

g

/

m

l无法显示该图片。无法显示该图片。氢化可的松中其他甾体检查硅胶GF254二氯甲烷-乙醚-甲醇-水385

:

60

:

15

:

2展开后晾干

105℃干燥10min碱性四氮唑蓝显色供试品

对照品3.0mg/ml

60μg/mlCHCl3-MeOH(9:1)醋酸氟轻松

检查 有关物质取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9：1）稀释成

0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5μl，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97：3）为展开剂，展开后晾干，在105℃干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。限量%=0.06

·100%=2%3供试品的量标准溶液的浓度特点：（1）简便易行，不需特殊的仪器；不需对照品；只能控制单个杂质的限量；要求杂质与主成分的显色灵敏度接近。HPLC法高低浓度对比法）色谱条件色谱填充柱：十八烷基硅烷键和硅胶。流动相：各种不同比例的甲醇-水混合溶剂。检测器：紫外（214nm，254nm，281nm， 230nm，288nm）。供试液和对照液的制备：将供试品用甲醇溶解配制成高（1）、低（2）二种浓度的溶液。5.判定法：溶液显示的杂质峰数不得超过1个或3个或4个等；各杂质峰面积剂其总和不得大于溶液主峰面积的1/2或3/4或杂质峰面积不得大于溶液或者主峰面积的3/4（如：黄体酮）。即按各药品项下规定的杂质峰的数目和面积的要求进行判定。取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每1ml含1mg的供试品溶液与每1ml含0.01mg的对照溶液。用含量测定项下的方法取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪满量程的

20％。丙酸睾酮

检查 有关物质再分别取供试品溶液和对照液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液显示的杂质峰面积不得大于对照液主峰面积的1/2，各杂质峰面积及其总和不得大于对照溶液主峰面积。特点：需特殊的仪器；不需对照品；可以控制杂质的总量；黄体酮中有关物质的检查取本品适量，精密称定，以甲醇溶解并稀释制成每1ml中

约含1mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取1ml，置

50ml

量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调整检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的50%。再精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl

，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的1.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，不得多于1个。其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的3/4

。（二）硒来源

合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢原理(中国药典)环己烷A378nmSe4+2,3-二氨基萘fi

4,5苯并苯硒二唑pH2.0

–

0.2剧毒盐酸羟胺fi

Se4+氧瓶燃烧fi

Se6+方法（三）残留溶剂（甲醇和丙酮）GC法示例地塞米松磷酸钠方法：对照液的制备：精密量取甲醇10μl（相当于7.9mg）与丙酮100μl（相当于79mg），置100ml量瓶中，精密加0.1%（ml/ml）正丙醇（内标物质）溶液20ml，加水稀释至刻度，摇匀；供试品溶液的制备：另取本品月约0.16g，精密称定，置

10ml量瓶中，精密加入上述内标溶液2ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，检查：取上述溶液，照气相色谱法，用高分子多孔小球色谱柱（按正丙醇计算的理论板数应大于700），在柱温

150℃测定。含丙酮不得过5.0%（g/g），并不得出现甲醇峰。本品在生产工艺中使用大量甲醇和丙酮，因此要检查。甲醇属于第二类溶剂，检测限为0.3%丙酮属于第三类溶剂，检测限为0.5%（四）游离磷酸地塞米松磷酸钠氢化可的松磷酸钠倍他米松磷酸钠氢化泼尼松磷酸钠对照品法测定原理：酸性条件下，磷酸与钼酸作用生成磷钼酸铵，再经还原形成磷钼酸蓝（钼蓝），在740nm波长处有最大吸收。fi24103432-4+)

]

nH

O¿fi

H

POPO3-MoOH4钼蓝‹

还原

H

[P(MoO方法：供试液对照液A对还原fi钼酸铵fi740nmfi

A样检查 游离磷酸地塞米松磷酸钠精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放置30～50分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml法处理的吸收度比较，不得更大。（五）雌酮原理

Zimmermann反应间二硝基苯fi

紫红色碱性KOH乙醇OC

CH2高纯度OH

ON

O

2N

O

2（六）乙炔基原理HNO3H2ONaOHNaNO3R

C

CHAgNO3R

C

CAgHNO3例：炔诺孕酮中乙炔基的检查四、含量测定HPLCUV法比色法非水溶液滴定法（一）UV法△４-3-酮240nm肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯环280nm雌激素许多甾体激素分子中存在Δ4-3-酮基（C=C-C=O）和苯环（C=C-C=C）共轭系统，因而在紫外光区有特征吸收，240nm附近有最大吸收，有苯环的在280nm附近有最大吸收，可用于含量测定。95版中国药典中25中甾体激素原料及片剂用该法测定含量，占本类药物分析的28%，仅次于HPLC。氢化可的松的含量测定取本品20片，精密称定，研细,精密称取适量（约相当于醋酸氢化可的松20mg），置200ml量瓶中，加无水乙醇适量，使醋酸氢化可的松溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；另取醋酸氢化可的松对照品约20mg，精密称定，置200ml量瓶中，加无水乙醇适量，使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液与对照品溶液各1ml,分别置干燥具塞试管中,各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液1ml，摇匀,再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40～45分钟，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在485nm的波长处分别测定吸光度，计算，即得。醋酸可的松片的测定方法：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（相当于醋酸可的松20mg），置100ml量瓶中，加无水乙醇75ml，时时振摇约1h，使醋酸可的松溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5ml，置另一100ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，在238nm的波长处测定吸收度，按醋酸可的松的吸收系数（E1m）为390计算，即得。（二）比色法适用于非分光光度活性药物使待测组分光谱位移，避免干扰增加测定灵敏度增加选择性弱、非分光光度活性药物强分光光度活性药物化学反应2，3，5-三苯基氯化四氮唑（缩写为TTC），其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲簪，λmax在480~490nm，也称红四氮唑（缩写为RT）蓝四氮唑（缩写BT），其还原产物为暗蓝色的双甲簪，λmax在525nm左右。四氮唑比色法四氮唑的种类TTC还原成

TFC6H5CNNNNHC6H5C6H5+

HClC

H6

5CNNNC6H5C6H5N+Cl+2e+2H+反应原理皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲簪。四氮唑盐C17

-a-醇酮基fi

有色甲瓒OH

-

[还原]测定方法USP（23）采用蓝四氮唑；中国药典（1995版）和BP（1993）采用红四氮唑。供试液对照液TTCfi

氢氧化四甲基铵fiA‹

25℃40～45min暗中国药典收载氢化可的松软膏的含量测定方法如下1.对照品溶液制备：精密称取氢化可的松对照品20mg，置

100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。2.供试品溶液的制备：精密称取本品适量（约相当于氢化可的松

20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热溶解，再置冰浴中放冷后，滤过，滤液滤入100ml量瓶中，同法提取3次，滤液并入量瓶中，放置室温，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。3.测定法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液1ml，摇匀，再精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃暗处放置40~45min，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。4

讨论（1）基团对反应速度的影响C11=

O＞

C11－OHC21－OH＞C21

－酯（2）溶剂、水分的影响含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→几无反应醛

→

A↑

—

无醛无水乙醇—无水乙醇（3）温度与时间t℃↑→ν↑→甲瓒分解↑→%↓ChP

25℃

40minBP

30℃

1h（4）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：皮质激素溶液fi

四氮唑盐fi

碱试液反应过程反应产物（5）

O2与光线的影响怕光

→避光、快速O2影响颜色强度和稳定性→隔绝空气、快速、充N2（6）干扰物的影响赋形剂、山梨醇、角鲨烯等油膏、冷霜等→先分离后测定4.特点：缺点

影响因素太多优点

测定结果能指示药品的稳定性（氧化及降解产物无此反应）肾上腺皮质激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基1.

原理异烟肼fi

异烟腙（黄）3C

-酮基‹HCl（缩合）异烟肼比色法原理甾体激素C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合

形成黄色异烟腙，在420nm具有最大吸收。3C

-酮基‹异烟肼fi

异烟腙（黄）HCl（缩合）倍他米松磷酸钠

含量测定对照液：精密称取倍他米松磷酸钠对照品（约相当于倍他米松20mg），置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。摇匀。供试液：精密称取本品适量（约相当于倍他米松20mg），置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。测定法：精密量取上述溶液各1ml，分别置25ml量瓶中，各精密加异烟肼溶液（异烟肼75mg，盐酸0.1ml，加甲醇溶解并稀释至100ml）20ml，摇匀，置60℃水浴中保温1小时，冷却，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在420nm的波长处分别测定吸收度，计算含量。3.讨论（1）溶剂的选择异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇无水甲醇无水乙醇(2)酸、异烟肼的量盐酸:异烟肼=2:1酸度↑→

异烟肼盐↓酸度↓→

A↓样品

:

异烟肼

=

1

:

8

→ν↑（3）水分、温度、O2与光线的影响含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不挥发溶剂、不吸收水分时→O2与光线无影响温度t℃

↑

→

ν↑（4）反应速度C3=O

＞C17=O

、C20=OC11=O

不反应反应专属性

C3－酮基KOBER反应比色法指雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在

515nm附近有最大吸收。反应分两步：与硫酸-乙醇共热产生黄色，在465nm处有最大吸收；加水或稀硫酸稀释重新加热显桃红色，在515nm处有最大吸收。雌激素H2Ofi

桃红H2SO4

-乙醇fi

黄色△△λmax=465λmax=515OHCH3O雌二醇-3-甲醚CH3CH3OCH3CH3Oλmax=465λmax=515H2SO4fiH

2SO

4H2O（三）HPLC法

USP、BP、JP均采用（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）特点

用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快特点：样品用量少、灵敏度高、分离效能好、快速等优点，各国药典多采用。中国药典89种甾体激素原料和制剂中，有43种采用HPLC

法（内标法多），占该类药物分析方法的48%，居首位。

反相分配色谱最广。固定相常用十八烷基硅烷键和硅胶；

流动相甲醇-水-乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水等的混合液。为了提高分离效率、获得满意

的峰形，有时在流动相中加入醋酸缓冲液或磷酸缓冲液调

节流动相的pH值，紫外直接检测。醋酸泼尼松龙的测定方法如下：色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键和 硅胶为填充柱，甲醇-水（70：30）为流动相，检 测波长为240nm。理论塔板数按醋酸泼尼松龙计 算应不低于3000，醋酸泼尼松龙和内标物质峰的 分离度应符合要求。内标溶液的制备取醋酸氟氢松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。3.测定法取醋酸泼尼松龙对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.50mg的溶液；精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品适量，同法测定，按内标法以峰面积计算，即得。复习（鉴别）官能团反应药物C17

α-醇酮基菲林试剂，多伦试剂，四氮唑试液皮质激素类酮基羰基试剂C3

和C20

位上有羰基的药物甲酮基亚硝基铁氰化钠如黄体酮酚羟基重氮苯磺酸雌激素炔基硝酸银试液炔雌醇，炔诺酮，炔诺孕酮（雌激素类）特殊杂质检查特殊杂质来源检查方法有关物质药物合成反应物，中间体及产物中，各个环节都可能引入TLC，HPLC硒有些甾体激素在生产工艺中使用二氧化硒脱氢，引入杂质硒中国药典硒检查法残留溶剂（甲醇、丙酮）药物制备过程中引入GC游离磷酸盐药物生产和存储过程引入UV方法

紫外官能团△4-3-酮，△1，4-3-酮芳香A环，酚羟基对象肾上腺皮质激素雌、雄激素，避孕药四氮唑17位

-醇酮基肾