了解免疫标记技术

免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。1941年Coons建立荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique），使组织和细胞中抗原物质的定位成为可能。1956年Yalow和Berson建立放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA），普遍应用于体液中的激素、微量蛋白及药物的测定。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的结果。酶用作免疫技术标记物是从抗原定位开始的。上个世纪70年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定，其后得到迅速发展。第四章免疫标记技术第一节荧光免疫技术第二节酶免疫技术第三节放射性免疫第四节免疫胶体金技术第一节荧光免疫技术1.1有关荧光的基本知识1.2荧光抗体技术1.3荧光免疫测定1941年，Coons等首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。1.1有关荧光的基本知识一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。（二）荧光效率荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率＝发射荧光的光量子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。二、荧光物质（一）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明等。（1）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长520~530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。FITC其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。（2）四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl-rhodamineisothiocyanate，TRITC）最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。（二）其他荧光物质（1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例①，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。例②，碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。（2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光。Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。1.2荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记（1）用于标记的抗体：具有高特异性和高亲和力。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取IgG后再作标记。（2）作为标记的荧光素：①具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。（3）常用的标记蛋白质的方法：有搅拌法和透析法两种。以FITC标记为例。①搅拌法：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液，在室温持续搅拌4～6h后，离心，上清即为标记物。适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点：标记时间短，荧光素用量少。缺点：影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。②透析法：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC的0.01mol/LpH9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，然后透析除去游离色素。最后低速离心，取上清。适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。优点：标记比较均匀，非特异染色也较低。（二）荧光抗体的鉴定与保存鉴定标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。①抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定效价大于1:16者较为理想。②荧光素与蛋白质结合比率（F/P）用于固定标本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜用于活细胞染色的以F/P＝2.4为宜。抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。③荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。二、免疫荧光显微技术基本原理使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。（一）标本的制作保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上1～2层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。（二）荧光抗体染色在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用25～37℃30min，不耐热抗原的检测则以4℃过夜为宜。用PBS充分洗涤，干燥。（三）荧光显微镜检查染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。（四）实验的类型（1）直接法用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合（如下图）。优点：操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少。缺点：敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。（2）间接法本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。（3）补体结合法在间接法的第一步抗原抗体反应时，加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。优点：敏感度高，且只需一种抗体。缺点：易出现非特异性染色，补体不稳定，每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。（4）标记法标本法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。三、在医学检验中的应用荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。①细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。速度快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能作为一种补充手段使用，而不能代替常规诊断。②病毒学检验，普通光学显微镜看不到病毒，荧光抗体技术可检出病毒及其繁殖情况。③寄生虫感染诊断，间接荧光抗体染色法有非常广泛的应用。间接免疫荧光试验（IFAT）是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。常用抗原为疟疾患者血液中红内期裂殖体抗原。IFAT对肠外阿米巴、尤其是阿米巴肝脓肿也有很高的诊断价值，所用抗原是阿米巴培养物悬液或提取的可溶性抗原。④检测自身抗体检测，在自身免疫病的实验诊断中应用广泛。其突出优点：能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应的组织成分；并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。主要有抗核抗体、抗平滑肌抗体和抗线粒体抗体等。⑤荧光抗体技术的一种特殊应用是流式细胞分析（flowcytometry）。在这种分析方法中检测仪器不是荧光显微镜；检测对象不是固定了的标本，而是将游离细胞作荧光抗体特异染色后，在特殊设计的仪器中通过喷嘴逐个流出，经单色激光照射发出的荧光信号由荧光检测计检测，并自动处理各处数据。1.3荧光免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA）以镧系元素铕（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。TR-FIA测定原理示意图双抗体夹心法TR-FIA反应程序示意图所用检测仪器为时间分辨荧光计，与一般的荧光分光光度计不同，采用脉冲光源（每秒闪烁1000次的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长镧系荧光。检测灵敏度可达0.2～1ng/ml。二、荧光偏振免疫测定（fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA）用于小分子物质特别是药物的测定。荧光物质经单一平面的偏振光蓝光（485nm）照射后，可吸收光能跃入激发态；在恢复至基态时，释放能量并发出单一平面的偏振荧光（525nm）。偏振荧光的强度与荧光物质受激发时分子转动的速度成反比。大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光弱。利用这一现象建立了荧光偏振免疫测定。FPIA的试剂为荧光素标记的药物和抗药物的抗体。模式为均相竞争法，标本中的药物与荧光标记的药物与一定量的抗体竞争结合。反应平衡后，与抗体结合的荧光标记药物的量与标本中药物浓度的量呈反比。因此在FPIA中测定的偏振荧光强度与标本中药物的浓度呈反比。第二节酶免疫技术2.1酶免疫技术的分类2.2均相酶免疫测定2.3ELISA的原理和类型2.4ELISA的技术要点2.5膜载体的酶免疫测定2.1酶免疫技术的分类酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。酶免疫技术一般分成酶免疫组化技术和酶免疫测定两大类。①酶免疫组化技术与荧光抗体技术相似，酶标记抗体与组织切片上的抗原起反应，然后与酶底物作用，形成有色沉淀物。可以在普通光学显微镜下观察。如果酶作用的产物电子密度发生一定的改变，则可用电子显微镜观察，称为酶免疫电镜技术。②酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。例：以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下：

Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*

Ab*Ag代表结合的标记物，Ab*为游离的标记物。如果在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。如果在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物*失去其特性（比如酶失去其活力，荧光物质不显荧光），则不需要进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。2.2均相酶免疫测定一、酶扩大免疫测定技术（enzymemultipliedimmunoassaytechnique，EMIT）主要检测小分子抗原或半抗原，在药物测定中取得较多应用。是最早取得实际应用的均相酶免疫测定方法，由美国Syva公司研究成功并定名。此法试剂盒的商标取名为EMIT。EMIT原理示意图二、克隆酶供体免疫测定（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）CEDIA主要用于药物和小分子物质的测定。利用重组DNA技术制备β-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzymeacceptor，EA），小片段称为酶供体（enzymedonor，ED）。两个片段本身均不具酶活性，但在合适的条件下结合在一起就具有酶活性。利用这两相片段的特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定。2.3ELISA的原理和类型一、基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量测定基本原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。④用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。双抗体夹心法二、方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，有多种类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法（检测抗原最常用的方法）根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。优点：操作简单，反应时间短，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法。利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。抗抗体：如酶标羊抗人IgG抗体（四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。标本（含抗原）参考品（不含抗原）参考管待测管（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。捕获法：先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除非特异性IgG后再测定特异性IgM。（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。桥连ABC-ELISA夹心法测抗原示意图（avidinbiotincomplex-ELISA）2.4ELISA的技术要点ELISA的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。一、试剂的制备ELISA的主要试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③与标记酶直接关联的酶反应底物。（一）固相载体ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是8×12的96孔式。ELISA载体最常用的是聚苯乙烯。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。（二）抗原和抗体

ELISA要求：抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。抗原有三个来源：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。抗体有多克隆的和单克隆的。抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。（三）免疫吸附剂固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。载体不同，包被也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA板孔中在4℃过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。（四）酶和底物酶要求：纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。受检标本中尽量不存在与标记酶相同的酶。底物要求：易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。最常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）①HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，复合酶，主酶（酶蛋白）为无色，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基（亚铁血红素）是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应：HRP的常用供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB稳定性好，无致异变性。经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；应用日见增多。ABTS，灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。②碱性磷酸酶（AP）。大肠杆菌提取的AP最适pH为8.0；小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基苯酚，在405nm有吸收峰。NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。AP系统，其敏感性一般高于HRP系统，空白值较低。AP稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。除HRP和AP以外，在商品ELISA试剂中应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。（五）结合物酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。1、戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。戊二醛一步法（如连接AP）操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。戊二醛二步法（如连接HRP），先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。2、过碘酸盐氧化法本法只用于HRP的交联。HRP含18％碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。三、测定方法的标准化缓冲液可于冰箱中短期保存，使用前应观察是否变质。蒸馏水的质量在ELISA中也至关重要，最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。以板式ELISA为例，介绍有关注意事项。（一）加样除了包被外，一般需进行平行加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。应使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。（二）保温在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，反应温度和时间应按规定的要求。保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。板子不能重叠。板上应加盖避免蒸发，或板自放于底部垫有湿纱布的金属湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，室温较低时更为重要。底物加入后，反应时间和温度通常无严格要求。若室温高于20℃，可放在实验台上，以便不时观察。（三）洗涤洗涤是决定实验成败的关键。目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。（四）比色如阴性对照颜色极浅，在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果，准确性决定于板底的平整与透明度和比色计的质量。2.5膜载体的酶免疫测定一、斑点-ELISA（dot-ELISA）①以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；②底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色。硝酸纤维素膜吸附性能强，一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条，并在同一张膜条上点有多种抗原，将整个膜条与同一份血清反应，则可同时获得对多种疾病的诊断结果。斑点-ELISA的缺点：操作麻烦，洗涤的操作很不方便。斑点-ELISA二、免疫印迹法免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southernblot相类似，亦被称为Westernblot。免疫印迹法本法综合了SDS的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段。不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。如在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。三、重组免疫结合试验（recombinantimmunobindingassay，RIBA）与免疫印迹法不同之处在于特异性抗原不通过电泳分离转印，而是直接分条加在固相膜上。RIBA十分适合于含复杂抗原成分的病原体抗体的分析，除抗HCV外，也成功地用于抗HIV抗本的测定。第三节放射性免疫3.1放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）3.2免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）放射免疫分析是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，用于定量测定受检标本中的抗原。最初建立的方法模式是以核素标记的抗原与受检标本中抗原竞争的测定模式，为区别于前者，称为免疫放射分析。两种方法均在医学检验中得到了广泛应用。3.1放射免疫分析（RIA）1960年，Yalow和Berson创建该分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法的灵敏度高达ng甚至pg水平。测定准确性良好，ng量回收率接近100％。特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。一、基本原理标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。标记抗原和抗体的量是固定的。抗体的量一般取用能结合40％～50％的标记抗原。受检标本中的非标记抗原是变化的。根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应结果。放射免疫分析原理示意图剂量反应曲线（一）标记物标记用的核素有放射γ射线（131I、125I、57Cr和60Co）和β射线（14C、3H和32P）两大类。放射性核素的选择首先考虑比活性。例如125I比活性的理论值是1.74×104Ci/g，有较长半衰期的14C最大比活性是4.5Ci/g。两者相比，1mol125I或14C结合到抗原上，125I的敏感度约比14C大3900倍。125I有合适的半衰期，低能量的γ射线易于标记，125I是目前常用的RIA标记物。（二）标记方法标记125I的方法可分两大类：直接标记法和间接标记法。①直接标记法是将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上。优点：操作简便，效率高。缺点：只能用于标记含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性，则该活性易因标记而受损伤。最常用的是：氯胺T直接标记法。氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐，在水溶液中逐渐分解形成次氯酸，是一种氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺T将125I的氧化为125I+，125I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。②间接标记法（又称连接法）以125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。缺点：操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。优点：反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失；可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质；如直接法标记引起蛋白质酪氨酸结构改变而损伤其免疫及生物活性时，也可采用间接法。（三）标记物的鉴定1、游离碘应占总放射性碘的5％以下。否则应重新纯化去除这部分游离碘。2、免疫活性标记时总有部分抗原活性损失，但应尽量避免。3、放射性比度标记抗原必须有足够的放射性比度。（四）抗血清的检定含有特异性抗体的抗血清是放射免疫分析的主要试剂，常以抗原免疫小动物诱发产生多克隆抗体而得。抗血清的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。抗血清质量的指标主要有亲和常数、交叉反应率和滴度。1．亲和常数（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗体与相应抗原的结合能力。K值的单位为mol/L，即表示1mol抗体稀释至若干L溶液中时，与相应的抗原结合率达到50％。抗血清K值越大，放射免疫分析的灵敏度、精密和准确度越佳。抗血清的K值达到109～1012mol/L才适合用于放射免疫分析。2、交叉反应率交叉反应率反映抗血清的特异性，交叉反应率过大将影响分析方法的准确性。放射免疫分析测定的物质有些具有极为类似的结构，例如甲状腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。针对一种抗原的抗血清往往对于其类似物会发生交叉反应。3、滴度滴度系指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度。反映抗血清中有效抗体的浓度。在放射免疫分析中滴度为在无受检抗原存在时，结合50％标记抗原时抗血清的稀释度。二、测定方法用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。（一）抗原抗体反应抗原（标准品和受检标本）、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。（二）B、F分离技术在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（F）的分离。对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。（三）放射性强度的测定B、F分离后，即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类，液体闪烁计数仪（β射线，如3H、32P、14C等）和晶体闪烁计数仪（β射线，如125I、131I、57Cr等）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。如果知道这个测量系统的效率，还可算出放射源的强度，即dpm（衰变/分）或dps（衰变/秒）。每次测定均需作标准曲线图。放射免疫分析标准曲线示例3.2免疫放射分析IRMA是从放射免疫分析（RIA）的基础上发展起来的核素标记免疫测定。特点：用核素标记的抗体直接与受检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段。1968年Miles和Heles把IRMA改进为双位免疫结合，在免疫检验中取得了广泛应用。单位点IRMA原理示意图一、基本原理IRMA属固相免疫标记测定，其原理与ELISA极为相似，不同点主要为标记物为核素及最后检测的为放射性量。双位点IRMA原理示意图双位点IRMA的反应模式与双抗体夹心ELISA的模式相同。不论是单位点还是双位点IRMA，最后测得的放射性与受检抗原的量呈正比。二、IRMA与RIA的异同点1．标记物在RIA中核素标记抗原，在IRMA中核素标记抗体。标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。2．反应速率反应速度与反应物的浓度呈正比。在IRMA中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较RIA快。3．反应模式RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关的直线关系。4．特异性IRMA一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA。5．标准曲线的工作浓度通常RIA的工作范围为2～3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。6．分析误差IRMA的批内和批间变异均比较小。7．其他RIA可以测定大分子量与小分子量的物质双位点IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在RIA中应用的多为单克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。第四节免疫胶体金技术4.1原理4.2胶体金的制备4.3胶体金标记蛋白的制备4.4胶体金标记技术在免疫学中的应用胶体金(colloidalgold)是氯金酸(chloroauricacid)的水溶胶，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。1971年Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快。1978年，Geobe