仪器分析在花色苷中的应用

仪器分析在花色苷中的应用第1页，课件共23页，创作于2023年2月1花色研究概况色素的化学分析：类胡萝卜素、花色素苷、叶绿素、甜菜色素

花色变异机理色素生物合成途径（基因、关键酶）分子育种改良花色第2页，课件共23页，创作于2023年2月影响花色形成的主要因素色素组成助色素：黄酮醇、二氢黄酮等金属离子：Al3+、Fe3+、Mg2+等pH值细胞结构和内环境第3页，课件共23页，创作于2023年2月第4页，课件共23页，创作于2023年2月2花色苷的化学结构和性质2.1花色苷化学结构

花色苷（anthocyanin）为黄酮类化合物，是由花色素和各种糖形成的配糖体。花色素（anthocyanidin）是具有类黄酮典型结构的2-苯基苯并吡喃阳离子的衍生物，以C6－C3－C6

为基本骨架，目前已知有20种花色素。形成配糖体的主要的糖有：葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、芸香二糖、龙胆二糖、槐二糖等。花色素在3、5、7等位置与糖结合后形成糖苷，因此花色苷也相应地被分为单糖苷、二糖苷或三糖苷.第5页，课件共23页，创作于2023年2月第6页，课件共23页，创作于2023年2月2.2影响花色苷颜色稳定性的主要因素花色苷的酰化作用：有机酸如ｐ-香豆酸、咖啡酸和琥珀酸等通常与花色苷的3、5、7或3′位上的糖结合,形成单酰、二酰或多酰花色素苷。酰化花色苷参与分子内辅助着色或分子间辅助着色反应，是花色苷在较宽的pH值范围内颜色稳定表现。pH值的作用：在溶液介质中,花色苷会随pH有几种结构的变换。对于一个给定的pH值,在花色苷的4种结构之间存在着平衡:蓝色的醌式(脱水)碱、红色的花钅羊正离子、无色的甲醇假碱和查尔酮。金属离子：酰化花色素与辅助色素、金属发生反应,形成复合花色素苷。第7页，课件共23页，创作于2023年2月研究的主要对象：羟基的位置和数量、糖的类型及位置、酰基化作用、取代基等研究的主要方法：光谱法－－紫外可见光谱、红外吸收光谱，色谱法，核磁共振波谱法，质谱法3花色素苷的定性分析第8页，课件共23页，创作于2023年2月3.1光谱法3.1.1紫外可见光谱法紫外-可见光谱很早就被人们应用于花色苷的结构鉴定。该法主要有如下几点：①花色苷最大吸收波长一个在可见光区的500～540nm附近，另一个在紫外275nm附近，通过测定色素的最大吸收波长即可判断是否为花色苷类色素。②如果向花色苷的0.01%盐酸甲醇溶液中滴加3～5滴ＡlＣl3甲醇或乙醇溶液,出现蓝移，即最大吸收波长增加，说明Ｂ-环有邻位酚羟基，即可区分Ｂ-环无邻位酚羟基的天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素和Ｂ-环有邻位酚羟基的矢车菊色素、牵牛花色素、飞燕草色素。第9页，课件共23页，创作于2023年2月③根据花色苷最大吸收波长处的吸光度和440nm处的吸光度的比值Ａ440/Ａmax，参考文献后，可以判断糖苷的位置。④根据花色苷在300～330nm间有无吸收峰可判断该色素分子是否有酰基，如果有吸收峰，表明该色素有酰基存在。⑤根据花色苷在440nm处是否有肩峰，可以判断该色素5号位的羟基是否被取代。如果5号位的羟基没有被取代，则该色素在440nm处有肩峰。⑥根据花色苷在紫外光下是否有荧光，可判断该色素是否在5号位有取代基，如果有荧光则表明该色素在5号位有取代基。第10页，课件共23页，创作于2023年2月

3.1.2红外吸收光谱

目前,红外吸收光谱应用于花色苷的结构鉴定不太广泛。花色苷的红外光谱主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基和甲氧基四部分。其中杂环的C＝O键的吸收峰在1630-1620cm-1，苯环和杂环的C一C键有三个吸收峰：Ⅰ：1605-1580cm-1，Ⅱ

：1577-1565cm-1，Ⅲ：1518-1485cm-1

。苯环C-H键的吸收峰在900-800cm-1，4-H:905－885cm-1，6-H:839-848cm-1，8-H:809一830cm-1。B环C-H键的吸收峰位置受取代基影响，不同的苷原也不相同。甲氧基和经基的吸收峰在1120-1010cm-1。花色苷的乙酞化产物的C=O键引起的峰在1654－1695cm-1。第11页，课件共23页，创作于2023年2月3.2色谱法

利用色谱法进行花色苷的结构鉴定需要对花色苷进行酸水解、碱降解和过氧化物降解等处理，使花色苷中的糖苷配基、糖和有机酸游离出来，再通过标准的糖苷配基、糖和有机酸作对照或参考文献数据,进行色谱分析。各样品的分析方法主要有：微晶纤维素薄层层析法(CellucoseTLC)，纸层析，HPLC，分析糖类时还有采用衍生化气相色谱法的报道，RP-HPLC应用于花色苷结构鉴定也逐渐多了起来。第12页，课件共23页，创作于2023年2月3.3核磁共振波谱法

核磁共振技术是有机结构鉴定的重要手段之一。在分子生物学，药物化学，植物化学等诸多方面有广泛的应用。应用于花色苷的分析从二十世纪七十年代末已经开始了。常用的有，1H一NMR和13C一NMR谱法。花色苷在不同pH值条件下，会发生结构的变化，在酸性环境中呈钅羊盐离子态时较容易测定，所以常用以下溶剂：CD3-TFA-d(氘代甲醇-三氟醋酸)，DMsO-d6-TFA(六氘代二甲亚砜-三氟醋酸)，D2O-DCI(重水-氘代氯化氢)，CD3OD-DCl。各质子的信号范围：苷原9-6ppm，糖中半缩醛的质子6-4.5ppm，H>C=H<H7-6ppm，大多数糖的质子在4-3ppm。第13页，课件共23页，创作于2023年2月3.4质谱法

质谱是二十世纪初发展起来的物理分析方法。在一定条件下能对复杂的有机物给出确定的，可以重复的质谱图，由分子的断裂规律得到许多的结构信息。FAB(FastAtomBombardment)是八十年代发展出的新离子源，多采用惰性气体，如氢，氘等中性原子流轰击样品使之离子化。FAB一MS具有较高的灵敏度，适用于分析极性大分子量较大的化合物。在花色苷的研究中主要用于花色苷的分子量的确定。第14页，课件共23页，创作于2023年2月4花色素苷的定量分析4.1含有很少或者不含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定：花色苷的最大吸收区在500～550nm范围内，而离这一范围最近的类黄酮的最大吸收范围在350～380nm。在新鲜的植物提取物中，因为很少含有在花色苷的最大吸收区发生吸收的干扰物质，花色苷总量可以利用比耳定量通过适当波长处的吸光度来测定。该方法测定花色苷总量需要在一个恒定的pH介质中进行。除了需要在定性的基础上确定花色苷的种类，还需要测定单个花色苷的最大吸收波长下的摩尔消光系数ε或比消光度Ｅ。又因为单个花色苷的差别很小，而且单个花色苷组成的比率未知，所以一般用平均比消光度avE来测定花色苷总量，误差小于0.2%。但是，单个花色苷的比消光度E是很难得到的，所以我们可以参考文献提供的数据。第15页，课件共23页，创作于2023年2月4.2含有干扰物质的体系中花色苷总量的测定：

4.2.1pH示差法：该法依据之一是花色苷发色团的结构转换是pH的函数，依据之二是超干扰作用的褐色降解物的特性不随pH而变化。通过实验，确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的pH值，根据Fuleki的公式可以计算出花色苷总量。

4.2.2差减法：差减法就是先测定样品在可见光区最大吸光度，经二氧化硫或亚硫酸盐漂白或过氧化氢氧化后，再测定一次吸光度,二者的差值就是花色苷的吸光度。参考用标准花色苷绘制的工作曲线，将吸光度换算成浓度。但是，差减法因所使用的漂白剂也能降低某些干扰组分的吸光度而使总花色苷浓度偏高。4.3单个花色苷的定量：

HPLC是广泛使用的方法。第16页，课件共23页，创作于2023年2月5其它应用细胞pH值的测定花瓣颜色的判定第17页，课件共23页，创作于2023年2月5.1花瓣细胞pH值测定

主要方法：荧光探针法、电化学法、核磁共振波谱法第18页，课件共23页，创作于2023年2月原理：荧光探针强度随pHi升高呈线形变化主要的荧光探针：SNAFL、BCECF、NERF等方法：荧光比值法优点：操作方便、对于细胞损伤小应用：Asen等人于1975年应用这一方法对二百余种植物的花进行了细胞pH值的测定第19页，课件共23页，创作于2023年2月5.2颜色的分析乳白玻璃投射法（Satio，1967）积分球法(Yasuda，1967)显微分光光度计法（Asen，1971）第20页，课件共23页，创作于2023年2月颜色测定实例八仙花花瓣的反射光谱的测量

新鲜的花瓣切成10×10mm2，固于一个盖玻片上，然后放在一个BaO白板上。将此板放在JASCOUbest－55分光光度计的一个积分球装置上，记录400～800nm的反射光谱。八仙花细胞原生质体可见光谱的测量将200μl原生质体悬浮液倒在聚赖氨酸预包裹的盖玻片上（18×18mm2），在室温下放置1min，去除悬浮缓冲液后，将盖玻片放于一个塑料盘中（35mmΦ）并加入2ml储存缓冲液（根据实验需求，KCl的浓度在0.1mM和10mM之间变化）。然后将其放在装有显微分光光度计（MCPD7000；Photal）的显微镜（IX70；Olympus）下观察，在直径10μm的光学光束条件下，测量有色原生质体在可见光区（400～800nm）的吸收光谱。

(K.Youshida,2003)第21页，课件共23页，创作于2023年2月6花色苷国内外研究实例植物材料色素实验方法研究者发表时间秋海棠花青素NMR（分析酰基化）、HPLC（分离）NodiveChirol，1992鸭趾草复合花色素鸭跖草苷UV-Vis、NMR、HPLCT.Kondo，1992蓝靛果花色苷红外吸收光谱李景琳、吴信子，1993土丁桂3-葡萄糖基咖啡酰葡萄糖基