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文档简介

兔子肌肉组织中DNA的提取主讲内容1.实验目的2.实验原理3.实验器材与试剂4.实验步骤5.注意事项实验目的1.学习并掌握动物组织中DNA的提取方法及其原理2. 熟悉肌肉中提取DNA的基本操作以及使用各个器材的基本方法。3.了解现今从组织中提取DNA的方法实验原理

动物的肌肉、心脏、肝、肾、脾等器官组织都是DNA的良好来源,其中肝脏的DNA虽然产量最大,但肝脏中丰富的基因组DNA酶对提取的DNA降解比较严重,相对来说，肌肉组织则由于具有相对少量的DNA酶而使得提取的DNA质量较好,尤其是新鲜组织的DNA产量高,质量好。肌肉DNA的提取一般有两种方法：SDS法和异硫氰酸胍法，但我们一般采用前一种，即SDS法。DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。器材和试剂1、仪器设备恒温水浴锅、台式离心机、移液器、玻璃匀浆器、离心管、吸嘴2、试剂（1）组织匀浆液：100mMNaCl，10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH8.0)，25mM乙二胺四乙酸（EDTApH8.0)。（2)2×细胞裂解缓冲液：200mMNaCl，20mMTris-HCl(pH8.0)，50mMEDTA(pH8.0)，蛋白酶K(200μg/mL)，1%SDS(十二烷基硫酸钠）（3）蛋白酶K：双蒸水配制10mg/mL，-20℃保存（4）TE缓冲液：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)，室温贮存（5）平衡酚(pH8.0)/氯仿/异戊醇（25:24:1）（6）3MNaAc、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水、生理盐水3、材料新鲜动物（兔子）肌肉组织实验步骤5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，缓慢颠倒混匀，冰上静置10min，12000rpm离心10min；6、用钝化的黄吸嘴吸取上清水相（含DNA，粘稠）入另一新1.5mL离心管中（注意不可吸取两相间的蛋白质）；7、估算上清体积，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，缓慢颠倒混匀，12000rpm离心10min；8、用钝化的黄吸嘴吸取上清水相入另一新1.5mL离心管中，并加1/10体积的3MNaAc和两倍体积的无水乙醇，盖上离心管盖子，缓慢颠倒混匀，冰浴30min后10000rpm离心5min；实验步骤9、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将管口的残余液滴除掉；10、用1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀物，10000rpm离心1min；11、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上吸去管口的液滴，短暂离心，用吸嘴将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥；12、加100μLTE缓冲液重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。注意事项1．动物肌肉应新鲜，处理应迅速，细胞破碎应完全。2．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤

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