细胞生物学实验考试范围

/细胞因子及抗体检测技术1。细胞因子的检测方法：1）生物学方法①依赖性细胞株：生物分析法②功能检测：生物分析法2）分子生物学方法①分子杂交技术：mRNＡ表达水平的测定②多聚酶链反应技术(PCR）：mＲNＡ的测定3）免疫学方法①免疫测定:免疫酶技术②功能测定与抗体抑制2。抗体检测技术免疫酶技术免疫荧光技术间接血凝试验放射免疫测定蛋白印迹免疫共沉淀亲和力测定3。ELISＡ实验原理：ELＩＳA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性③按一定步骤进行抗原抗体反应④加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析包被（cｏatiｎg）：将抗原或抗体固定在固相载体的过程。封闭(blocｋing)：是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISＡ后的步骤中干扰物质的再吸附。⑴．EＬＩSA出现“一片黄”的原因：①酶结合物浓度过高②底物不新鲜③洗涤不干净⑵ELISA出现“一片白"的原因：①载体吸附性能差②底物错③稀释液作包被液④加错试剂⑤包被时间过短⑥酶活力低或下降⑦样品含有NａＮ３单克隆抗体的制备1。抗体的定义免疫球蛋白：（结构概念）具有抗体活性并具有化学结构的球蛋白.抗体:（功能概念）与相应抗原特异结合具有免疫功能的球蛋白２．抗原：能与抗体结合的物质（能与T细胞的TＣR或Ｂ细胞的ＢCR结合，促使其增殖、分化、产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合,进而发挥免疫效应的物质。)免疫原：可刺激产生抗体半抗原只能结合，不能诱发与载体结合抗原决定簇：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,又称抗原表位。３．单克隆抗体定义：由一个B淋巴细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”。针对一个抗原决定簇,由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、性质均一、易于大量生产抗体生产技术的三个时代多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体基因工程抗体人源化全人源小型化噬菌体抗体库随着分子生物学发展，单抗技术有了新的突破嵌合抗体改型抗体人源化抗体转人基因小鼠5.亲本细胞的选择骨髓瘤细胞:①本身不分泌抗体②次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（ＨGPRＴ-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-)的骨髓瘤细胞Ｂ淋巴细胞：①经特定抗原免疫能产生目的抗体②免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系6．有限稀释法（常用）：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞.转基因大动物研究简答题:1请简单列举一下转基因技术的方法:• ＰronuclearInjection显微注射•ﻩRetｒovｉｒaｌＶｅctorIｎfectionｏfEmbｒyos病毒载体转染胚胎• Sperm－ｍｅdiaｔedGeneＴｒansｆer精子介导基因转移• EScｅlls胚胎干细胞•ﻩSomatiｃCｅllＮucｌｅａｒTranｓferｏｒCｌoning体细胞核转移或克隆2简述一下通过病毒载体转染胚胎，从而达到转基因目的的优缺点：Ｐros：• Ｉnfeｃtbotｈdivｉdingａndｎon－divｉｄingcｅllｓ感染分开的和未分开的细胞• ＨiｇhｔiterandbroadtａｒgｅtraｎgebｙｕsiｎgVSVGeｎveloppｒotｅiｎ具有较高的效价和宽广的靶位区间•ﻩInfectbｏtｈembryosandembｒyonicstemｃells感染胎盘和胎盘干细胞•Ｓuccessfulｉntraｎｓferringgenestoearlyembryoｓoｆmousｅ，ｒat，piｇ，caｔtleａndｍonｋeｙ。在小鼠,大鼠，猪，牛和猴子胎盘早期成功实施转移基因Ｃoｎs:• Activａtiｏｎｏfprｏto-onｃogenes（1／1０0，000chａnｃe）原癌基因激活• Silenceofthetraｎsgenｅ基因沉默•ﻩSｉzｅｌimiｔ（upto８.５kb)大小限制名词解释：１同源重组:同源重组(HoｍｏloｇusRecomｂｉnatioｎ)是指发生在姐妹染色单体（sisｔerchromaｔin）之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。2核移植（ＮuclｅarＴｒansfer）：核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制.蛋白质纯化１蛋白质分离方法：1硫酸铵沉淀法：2有机溶剂沉淀法３凝胶过滤法凝胶过滤层析(gelｆiltrａtioｎchrｏmａtogrａphy)法又称排阻层析或分子筛方法,主要是根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质的质量进行分离和纯化。４离子交换法离子交换层析（IonＥxcｈａngeChｒomatograpｈy简称为ＩEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。5疏水作用层析6亲和层析2钙调蛋白钙调蛋白是一种小分子量蛋白，能大量溶解于稀的中性水溶液中,带净负电荷，等电点为4.05，有钙依赖性疏水等性质。3.重组蛋白通过重组DNA技术获得的蛋白，通常为了便于目的蛋白的表达、检测、示踪及纯化，与目的蛋白一起融合表达一种多肽或蛋白亲和标签：（a）一步的吸附纯化（b）对三级结构和生物活性影响小(ｃ）可方便且专一的去除以产生天然蛋白质（ｄ）在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确(e)适用于大量的不同蛋白质４。包涵体的复性包涵体的复性主要有两种方式：①稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释②透析,超滤或电渗透析去除变性剂包涵体的复性还要注意以下几点：

1。首先要获得较高纯度的包涵体。ﻫ2．包涵体溶解要彻底,一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释,要有助溶措施。ﻫ3。透析前后均要离心

４.透析不能太快。ﻫ5。纯化的最佳条件要摸索.包含体复性三大原则：

1、低浓度2、平缓梯度3、低温细胞培养基本理论及技术１器官培养(organcｕlｔurｅ)：将活体的器官或器官一部分取出,在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。2组织培养（tissueｃulｔure）:把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。3。细胞培养(celｌculｔuｒｅ）从体内组织取出细胞模拟体内出现环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖,并维持结构和功能的一种培养技术。群体培养(mａｓsculture):将大量细胞置于培养瓶中,让其贴壁或悬浮生长,形成均匀的单层细胞或单细胞悬液.克隆培养（cloｎecｕltｕre）：即将少数的细胞加入培养瓶中,贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落,称为克隆.4细胞培养的特点:研究的对象是活的细胞研究的范围比较广泛研究的样本可以达到较好均一性培养条件易于改变和控制可进行各种因素对活体细胞影响的研究通过体外长期培养、传代，观察体外环境中遗传性状的改变5细胞培养基

既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。按物质状态分为半固体培养基和液体培养基;按来源分为合成培养基，天然培养基和无血清培养基无蛋白培养基，限定化学成分培养基.6天然培养基(血清）使用最普遍的天然培养基是血清。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质.与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。7无血清培养基（sｅruｍｆｒｅｅmeｄiuｍ，SFM)不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基.其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质组合置换培养基中的成分.优点：可避免血清批次间的质量变动，提高实验结果的重复性。避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。避免血清组分对实验研究的影响。有利于体外培养细胞的分化.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化.８限定化学成分培养基（chemiｃalｄefｉneｄmｅdium，CDM)培养基中的所有成分都是明确的，它同样不含有动物蛋白,同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。这种培养基更有利于分析细胞的分泌产物.目前已经有适合于２９３细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM问世。９。按其生长方式可分为贴壁型和悬浮型两大类.贴壁型生长细胞类型（a）成纤维型细胞(b）上皮型细胞（c)游走型细胞(d）多形型细胞１０培养细胞生命期（ＬiｆｅＳpanofCultureCelｌs）:指细胞在培养中持续增殖和生长的时间原代培养期（PriｍａryCｕlｔurｅ）：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周.传代期初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（DｉｐloｉdCellLine）。衰退期:细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡.１1细胞自发转化（SpontａneｏuｓＴrａnsfｏrmation）自发转化的标志之一是细胞可能获得永生性Ｉmmoｒtaｌｉｔy）或恶性性（Mａlｉｇｎanｃy).也称不死性，即细胞获持久性增殖能力。此细胞群体称无限细胞系（ＩｎfiｎiｔeＣｅｌlLｉne)，也称连续细胞系（CoｎtinuouｓCelｌLinｅ）.1２细胞传代和换液体外培养的细胞生存在培养瓶、培养皿的培养液中，生存空间和营养物质都是有限的，当其生长增殖达到—定密度后,需要分离出-部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏，代谢产物增多,pH变为酸性等不适宜细胞生长的因素,但细胞还未生长达到饱和浓度，又仍需继续培养,常采取更新营养液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长和繁殖的需要，这一过程叫换液。13血球计数板计数法基本原理是利用血球计数板的特殊标准容量,将显微镜下肉眼观察的细胞数换算成每毫升的细胞数,即细胞浓度。14细胞生长状况有关指标的检测细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经一个生长周期达到最大活细胞浓度的比率。生长倍数=培养后最大活细胞浓度/接种时的活细胞浓度细胞分裂指数:细胞增殖旺盛程度的指标。细胞分裂指数=细胞分裂相数/细胞总数（1000)×10０%细胞接种存活率又称细胞贴壁率。接种存活率＝(贴壁存活细胞数/接种细胞数）×100％克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状.克隆形成率=克隆数/接种细胞数×10０％

抗体工程1.多克隆抗体（ｐolyclｏnａlａｎtibｏdy）指由不同Ｂ细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清(含多种特异性抗体）.实际意义：（１)预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清à抗破伤风，胎盘球蛋白à抗病毒感染等副作用：à超敏反应(２）临床诊断,如：肥达氏反应--伤寒、副伤寒缺点:特异性差.2抗原决定族①一个抗原分子上可能有数个抗原决定族②每個抗原决定族产生一种特异性性抗体③蛋白质性抗原决定族含有六个以上氨基酸3人一鼠嵌合抗体（ChimerｉcAｎtiｂｏdieｓ)人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。4鼠单抗可变区的人源化CDＲ移植即把鼠抗体的CＤR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CＤＲ移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体.5小分子抗体小分子抗体包括Fab、Fv或sｃFｖ、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小,穿透力强;不含Fc,没有Fc带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接,直接获得免疫毒素等。6单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有两种方式：一是表达为包涵体的不溶性蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5％-２0％,但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连,单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。7单域抗体:即为VH,约为完整分子的1/1２。它只由一个结构域构成,故称单域抗体.单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性.最小识别单位：约为完整分子的1/8０—1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性.8双特异抗体和多价抗体双链抗体（Ｄiａｂodｙ）一词最早由Hoｌliｎｇeｒ等于1993年创造，是一种小分子的双价双特异性抗体片段。双特异性抗体（bispｅcifｉcａntiｂoｄy,BＳAb)是指能同时识别两种抗原的抗体。一种为肿瘤相关抗原，另一种为效应成分。既能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞，将效应细胞富集在肿瘤周围，而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。９抗体库技术抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达,然后筛选出所需的特异基因和抗体。标签蛋白纯化中的难题及其解决方法１.低产量的原因及解决方法：⑴结合力差标签未外露ﻩ使用变性剂提取液中的因素影响结合,如生物素添加抗生物素蛋白结合缓冲液条件没有优化（IMAＣ）ﻩ优化条件配基与标签之间结合动力学很慢 减小流速⑵低效洗脱洗脱缓冲液条件没有优化优化条件减少上样体积沉淀(柱上或洗脱后）采用线性梯度洗脱去污剂／ＮaCl2.蛋白纯化提高纯度方法：①多步纯化②双标签蛋白③优化结合洗脱条件④优化螯合的金属离子⑤重折叠和包涵体表达细胞生物学实验1１。实验室组成：基本要求:便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察基本需要：实验准备、无菌操作、控制培养基本组成：基本实验室:消毒准备室、制备室、无菌操作室辅助实验室：细胞学实验室、生化分析室、摄影室及暗室基本设备:冰箱天平酸度计恒温水浴锅磁力搅拌器液氮罐纯水设备灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜过滤灭菌装置喷雾消毒器紫外灯无菌操作设备:净化工作台生物安全柜细胞学鉴定设