ELISPOT技术原理及其应用

酶联免疫斑点

EnzymeLinkedImmunoSPOT2005.11.30Elispot实验结果（透明板）U-Cytech公司Elispot实验结果（PVDF板）U-Cytech公司ELISPOT技术原理及其应用ELISPOT技术起源与发展细胞与细胞因子ELISPOT技术原理ELISPOT和ELISA的区别ELISPOT的优点第一部分：前言ELISPOT技术原理及其应用1983年,Czerkinsky&Sedgwick：计数分泌抗体的B细胞；1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶;1988年，Czerkinskyet.al.:首次将应用扩展到细胞因子检测领域，TcellIFN-γ;同年业发展出双色标记技术；1995年，Schielenet.al.:首次将PVDF膜板引入ELISPOT1997年，Guiet.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。1.ELISPOT技术起源与发展ELISPOT技术原理及其应用T细胞在免疫系统中起着关键性的作用，尤其是起免疫调节作用的辅助细胞Th。它们参与了细胞免疫(Th1)和体液免疫(Th2)抗原或者有丝分裂原刺激T细胞、单核/巨噬细胞分泌细胞因子

Th1cellsIFN-γ,IL-2

Th2cellsIL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-13

TccellsIFN-γ,TNF-β,颗粒酶B，穿孔素

单核/巨噬细胞

TNF-a,IL-1b,IL-6,IL-10,IL-12

细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免疫系统调节网络。2.细胞与细胞因子ELISPOT技术原理及其应用用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色的方式将其表现出来。3.ELISPOT技术原理ELISPOT技术原理及其应用4.ELISPOT和ELISA的区别

ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都可检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同:ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是细胞频率；（整体水平与单细胞水平）ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测）ELISA检测的特异性表现在抗体上，ELISPOT检测的特异性及表现在双重的刺激源和抗体上。ELISPOT技术原理及其应用5.ELISPOT的优点

目前，检测细胞因子或者细胞免疫反应的方法有以下几种：ELISA、ELISPOT、FACS、Tetramer、3H胸苷参入法、51Cr释放法。高灵敏：度少至100－1,000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA的灵敏度高200倍。单细胞水平：即使只有一个阳性细胞也能够检测出来，比FACS灵敏。高通量：每个研究人员每天可作数百样本的检测。HighThroughputScreeningELISPOT技术原理及其应用在106抗原呈递细胞（APC）中混入已知数量的IFN-γ阳性T淋巴细胞，然后用三种方法分别进行检测。X坐标：各检测方法的检测结果Y坐标：每百万APC中实际IFN-γ+T细胞数量ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较ELISPOT流式荧光染色ELISAELISPOT技术原理及其应用第二部分：技术特点技术操作流程ELISPOT技术要点塑料板与膜板膜结构与抗体包被细胞处理有血清与无血清刺激物选择建立阳性对照调整适当的细胞浓度预培养法与直接法各种染色系统ELISPOT技术原理及其应用包被抗体4℃过夜，洗涤；封闭37℃1h；加入淋巴细胞和刺激原37℃孵育8-40h；冰水裂解并移出细胞，洗涤；加入生物素标记的检测抗体37℃1h，洗涤；加入酶联亲和素37℃1h，洗涤；加入显色底物，显色10~40min；获得斑点，计数。1，23456781.ELISPOT一般操作流程ELISPOT技术原理及其应用2.ELISPOT技术要点细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关CO2孵箱洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒的方式洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干ELISPOT技术原理及其应用塑料板：U-cytech公司特有的透明版操作简单，方便，省时，价廉，但是斑点不如膜板漂亮，适于初学者以及临床诊断。膜板：PVDF膜板、NC膜板操作复杂，但是斑点漂亮，适合有经验的实验者以及科学研究。3.塑料板与膜板ELISPOT技术原理及其应用塑料板：U-cytech公司特有的透明版优点：透明全塑料板，易于操作，可以随时观察细胞；可以快速包被，节省实验时间；可回收细胞和上清；价格只有PVDF膜板的一半。缺点：吸附能力比膜差，斑点松散，易受粒细胞的分解；裸视下斑点为灰白色，不如有颜色斑点明显；只有一种染色系统，不能用于多色分析。修饰的HRP/银染系统ELISPOT技术原理及其应用膜板：PVDF膜，NC膜优点：PVDF膜的吸附能力更强，斑点致密、圆润；斑点颜色鲜艳，易于判读；能用于多色ELISPOT实验。缺点：需酒精预湿等步骤，操作稍复杂；因为膜的渗漏问题，在洗涤步骤稍复杂；几乎不可能回收细胞和上清；膜的脆弱性，实验中的操作与保存更困难。HRP/DABAP/BCIP&NBTHRP/AECELISPOT技术原理及其应用IFN-IL-5IL-10IFN-PMA/ionomycin2.5x104hu-PBMCindirecttetanus105hu-PBMCindirectConA2.5x104hu-PBMCindirectICEPeptidePool2x105hu-PBMCindirectIL-5IL-12p70IFN-PMA/ionomycin2x105hu-PBMCindirectLPS/IFN-2.5x104hu-PBMCdirectICEPeptidePool2x105hu-PBMCindirectPVDF板、透明板的典型斑点图像ELISPOT技术原理及其应用4.膜结构和抗体包被通常的包被条件是4℃过夜，也可以室温2小时37℃包被不能超过1小时，否则包被效率急剧降低膜吸附能力远远超过包被抗体的量，所以需要封闭包被后必须接着封闭，否则包被抗体会逐渐失活封闭之后用纯水或PBS洗涤，可以在4℃长期存储关于膜的一些参数（单孔面积）厚度：120-150um最大蛋白吸附量：80-100ugELISPOT所需量：1ug包被抗体集中于膜表面1um(透明板容纳量为：30-40ug)ELISPOT技术原理及其应用从外周血提取淋巴细胞时,应避免凝血引起的细胞活性降低；血液越新鲜越好，全血不应该存放超过6小时。只能采用淋巴细胞提取液分离。提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞、粒细胞和杂质的干扰从小鼠的脾脏取淋巴细胞时，尤其要注意，加入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液预培养的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液变黄）会影响斑点的形成预培养后的细胞入ELISPOT培养板前应更换培养液ELISPOT实验的难点在于细胞处理与培养5.细胞处理

ELISPOT技术原理及其应用6.有血清与无血清血清是细胞培养所必需的添加品，ELISPOT有细胞培养的过程，所以需要血清但是血清批次间差异大、成分未可知，为ELISPOT增加了严重的不确定性因素。有些批次的血清严重干扰试验结果。无血清培养法已经成熟，其优点：成分固定，彻底消除了批次间的差异，结果可以在全世界的试验室之间比较。不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。目前只能用于直接法，间接法孵育时间过长，细胞生长受影响，结果不理想。119SFC267SFC我们自己的试验结果：PHA/10,000Hu-PBMC上：5%小牛血清（杭州）下：无血清培养基U-cytech)ELISPOT技术原理及其应用非特异性刺激物有丝分裂原ConA，PMA，PHA，Ionomycin特异性刺激物重组蛋白病毒载体或者病毒颗粒重叠肽段表位肽注意：直接在ELISPOT培养可能会因没有足够的刺激强度而导致斑点数少。此时可以采用预培养法。部分多价抗原刺激物导致细胞凋亡，可以换用单价抗原刺激物。核酸、激素等抗原刺激物的免疫原性较弱，应该加强刺激浓度、辅助刺激物、延长刺激时间等。7.刺激物选择

ELISPOT技术原理及其应用8.建立阳性对照非特异性刺激阳性对照：ConA伴刀豆蛋白A0.4-1.0ug/wellPHA植物血球凝集素0.3-1.0ug/wellIonomycin伊诺霉素50-100ng/wellPMA14烷酰佛波乙酯5.0-10ng/well特异性阳性刺激原：国际标准多肽池CEFCMV，EBV，influenzavirus在PBMC的IFN-γELISPOT分析中：自发斑点频率：10～50/百万PBMC细胞；(十万分之一）PHA刺激频率：104～105/百万PBMC细胞；（百分之一）CEF刺激频率：500～5000/百万PBMC细胞（千分之一）ELISPOT技术原理及其应用阳性对照实例未刺激40SFC/百万PBMCCEF刺激3，400SFC/百万PBMCPHA刺激26，000SFC/百万PBMC人PBMC40万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC1万/孔U-cytech无血清培养基人PBMC5万/孔U-cytech无血清培养基4265177ELISPOT技术原理及其应用9.调整适当的细胞浓度84449235519240万20万10万5万20-40万/孔形成最大密度的单层细胞根据所使用刺激原作初步调整ConAPHAPMA：0.5-5万/孔特异性刺激物：5-40万/孔根据预实验的斑点数目作精细调整人PBMC/CEF刺激U-cytech无血清培养基ELISPOT技术原理及其应用10.预培养法与直接法预培养法即：预先将细胞和刺激物加入24孔板中作预孵育和刺激，然后再加入ELISPOT板进行实验。大多数ELISPOT实验都可以用直接ELISPOT法得到可接受的结果。预孵育的优点：经过预孵育，斑点更分散，清晰可以除去贴壁的巨噬细胞，从而减少小斑点的影响；粒细胞的影响（虫啃）也可以大大减轻某些细胞因子通常很难用直接法得到结果，比如颗粒酶、IL-10预孵育的缺点：需要长时间孵育刺激，更为严格的无菌操作环境需耗费额外的物资和时间ELISPOT技术原理及其应用直接法PVDF刺激物：ICEPeptidePool40Hours,2X105Cell/Well预孵育法PVDF刺激物：ICEPeptidePool24+16Hours,2X105Cell/WellIFN-γ直接法与预培养法比较ELISPOT技术原理及其应用直接法PVDF刺激物：破伤风杆菌40Hours,2X105Cell/Well预孵育法PVDF刺激物：破伤风杆菌24+16Hours,2X105Cell/WellIL-10直接法与预培养法比较ELISPOT技术原理及其应用11.各种染色系统修饰的HRP/银染系统HRP/AECAP/BCIP&NBTHRP/DAB透明板：只有一种修饰的HRP/银染系统，白色不透明斑点。PVDF板：两种标记酶辣根过氧化物酶HRP----显色快，但是背景高(30min)AEC底物，颜色鲜艳，但易退色DAB底物，棕色斑点，着色稍牢固，但是板点松散碱性磷酸酶AP----显色慢，但是背景干净(2h)BCIP&NBT混合底物，蓝黑色，着色牢固ELISPOT技术原理及其应用第三部分：常见问题0.

无斑点斑点过少（影响斑点数量的因素）斑点过密斑点聚集在孔边缘问题斑点变花或者“拖尾”透明板“空斑”问题斑点明显偏大，并且弥散PVDF膜酒精预湿处理中的问题细胞凋亡对ELISPOT的影响ELISPOT技术原理及其应用

ELISPOT影响斑点形成的因素QualityantibodypairSolidsupport(polystyrene,nitrocellulose,PVDF)CellsfromSTLV/HTLV-infectedanimals/humansCellsourceoftissuesCellcomposition(Tcells,monocytes/macrophages,granulocytes,erythrocytesetc.)KineticscytokineproductionColoringsystemWashingconditions/dilutionbufferPreincubation(yesorno)ELISPOT技术原理及其应用斑点过密，细胞数量过多84419240万/孔5万/孔HumanPBMC,stimulatebyCEFpeptidepool人PBMC/CEF刺激U-cytech无血清培养基ELISPOT技术原理及其应用斑点聚集在孔边缘问题细胞集中于孔边缘与细胞在孔边缘的“层流阻滞”作用相关常见于PVDF膜板，膜的自然曲率影响改善方法接种细胞之后，不要摇动、振荡细胞体积不要超过100uL培养箱质量，铝箔包裹均匀受热方型孔板可杜绝细胞（斑点）的边缘效应洗板时的流水冲击力过大见于使用自动洗板机的情景ELISPOT技术原理及其应用这是震动所导致的斑点拖尾4.斑点变花或者“拖尾”这是细胞趋化所导致的斑点变花细胞在培养过程中震动导致斑点拖尾大部分斑点清晰，但部分出现“拖尾”，这并非震动的原因主要原因是DC所导致的细胞趋化作用常见于多价刺激，没有固定的DC比例，有很大的个体差异ELISPOT技术原理及其应用5.透明板“空斑”问题主要原因是粒细胞分泌或分解所至的酶解现象PVDF膜板因底部是白色的膜，同时斑点更致密而几乎看不出来改善方法采用单价刺激物，多价刺激物时更容易出现与PBMC分离的质量密切相关采用预孵育法可大大减轻这一现象ELISPOT技术原理及其应用我们自己的一个例子

（透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）ELISPOT技术原理及其应用6.斑点明显偏大，并且弥散这与包被抗体的质量、浓度有着密切的关系随着包被抗体浓度的增加，斑点变得清晰致密由于透明板的吸附能力差，这个问题更突出一些

0.2ug/well0.5ug/well1.0ug/wellELISPOT技术原理及其应用斑点偏大，弥散：我们自己的例子

（透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）ELISPOT技术原理及其应用7.PVDF膜酒精预湿处理问题不作酒精预湿过量酒精残留PVDF膜由于其疏水性，需要酒精预湿润有些公司的产品声称不需要预湿，但是斑点减少30-40%由于膜的通透性，加入过量酒精会导致其残留在膜的背面正确方法减少酒精用量至15ul70%乙醇快速预湿30秒，迅速用水或PBS洗涤至少三遍ELISPOT技术原理及其应用一个客户的实例ELISPOT技术原理及其应用细胞凋亡是高背景、无斑点的重要原因如果有30％细胞凋亡，完全不会出斑点；即使5％凋亡，也有严重影响对策：台盼蓝活细胞计数复苏冻存的细胞，可以先培养过夜，再做ELISPOT实验8.细胞凋亡对ELISPOT的影响ELISPOT技术原理及其应用第四部分：ELISPOT应用ELISPOT在国外的应用已经非常普遍，成为一项免疫学检测常规技术。凡是免疫学相关领域，都可以应用ELISPOT技术。我们国内，主要用疫苗研究方面，尤其是艾滋病疫苗。中国药品生物制品检定所：2003年《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法”

WHO：WHO-UNAIDS-sponsoredtrainingworkshop2003年在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能。在我国举办了技术培训学习班。ELISPOT在国内大规模应用的时代已经到来。ELISPOT技术原理及其应用国外ELISPOT应用疫苗研究HIV疫苗：在小鼠上检验抗原性；在猴体检验保护功效；在人体检验免疫原性；研究猴子感染SIV动力学；I型与II型HIV引发的CTL反应差别；HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性肿瘤疫苗抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；DC疫苗预防胃癌；DC疫苗治疗白血病；卵巢癌中的细胞免疫情况；日本临床DC疫苗治疗黑色素瘤的情况其它疫苗：疟疾疫苗：疟疾疫苗产生的CD4+8+和体液免疫反应；克隆病疫苗；肝癌疫苗；HPV疫苗；抗原表位筛选：结核杆菌的CTL表位；丙肝CTL表位；HIV-1表位肽；用肽库筛选T细胞表位肽；HIV蛋白酶和整合酶功能域中的CTL表位；痘病毒的T细胞表位自身免疫病研究、诊断风湿性关节炎、红斑狼疮研究红斑狼疮患者肾中的抗体分泌细胞的影响牛皮癣（银屑病）：致病机理，易感病人预测，治疗效果评估I-型糖尿病：致病机理，临床检测，易感病人预测麻风病多重硬化症结核病：多重抗药性、症状不明显的结核病早期诊断器官移植肾移植肝移植骨髓移植：次要组织相容性抗原(H)在骨髓移植中的影响；肝移植免疫耐受研究CCR2在移植排斥中的角色；研究移植耐受性差异；免疫系统研究研究抗体分泌细胞：B细胞的成熟；活化；抗体分泌细胞在粘膜的分布研究粘膜免疫反应：不同的粘膜部位；局部免疫与系统免疫；各种疫苗的粘膜保护效果研究基础免疫学：研究基因治疗中的外源蛋白免疫耐受；肿瘤疫苗对细胞免疫的刺激；研究DC细胞的功能调节；抗疟疾研究；HIV患者中细胞免疫强度和病毒载量的关系；同时评估多种细胞免疫反应；测定针对原生肿瘤细胞的免疫反应；急性丙肝病人体内的细胞免疫反应；老年人对流感病毒免疫反应低下的原因分析；ELISPOT技术原理及其应用ELISPOT在国内的应用HIV疫苗HBV(乙肝)疫苗SARS疫苗HEV(戊肝)疫苗乙肝诊断与治疗评估I-性糖尿病诊断肝移植排斥反应B细胞抗体分泌研究ELISPOT技术原理及其应用ELISPOT在HIV疫苗研究中的应用体液免疫与细胞免疫：细胞免疫在控制HIV主治方面发挥了主要作用目前没有任何疫苗能预防HIV的感染，但是可以减轻感染之后的发病情况，甚至不再发病。评价HIV疫苗的好坏不再与看它激发的抗体，而在于看它激发的病毒特异性细胞免疫反应。目前评价这个指标最好的方法就是：ELISPOT!疫苗免疫两周后，猴PBMC对HIV病毒裂解物的IFN-γELISPOT反应A,肌肉与粘膜联合免疫；B,单独肌肉免疫。

MakitaloB.et.al.

EnhancedcellularimmunityandsystemiccontrolofSHIVinfectionbycombinedparenteralandmucosaladministrationofaDNAprimeMVAbo