海洋微藻的细胞操作

海洋微藻的细胞操作第1页，课件共73页，创作于2023年2月海洋微藻细胞操作的意义微藻因为其结构简单和易于培养等特点，成为原生质体制备、再生和增殖、细胞融合以及细胞工程等细胞操作和基因工程研究的极好材料。绝大多数海洋微藻有细胞壁，其细胞操作收到了限制。因此，海洋微藻细胞操作的第一步是去除细胞壁，获得原生质体。第2页，课件共73页，创作于2023年2月通过原生质体进行细胞操作和遗传饰变的要点概况成为：（1）原生质体的分离（2）原生质体的培养及再生（3）细胞融合（4）把外源遗传物质、细胞器或微生物导入原生质体第3页，课件共73页，创作于2023年2月海洋微藻细胞操作研究的历史与现状50年代末期，Fuhs利用丝状体蓝藻制备得到原生质体。70年代其他种类的原生质体的制备也获得成功。这些微藻原生质体分离成功为海藻原生质体分离和培养研究提供了宝贵的基础资料，为80年代大型海藻原生质体分离和培养工作的活跃开展奠定了宝贵的基础。从80年代开始，微藻原生质体分离、培养以及细胞融合的研究逐渐向大型海藻转移，这种研究重点的转移似乎可以说明，大型海藻的遗传饰变更加困难和复杂，在理论和实践上有更多的问题需要解决。第4页，课件共73页，创作于2023年2月微藻细胞操作的有关问题微藻细胞操作的材料应具备下列特征

1.生长状态良好、健康

2.形态简单均一

3.细胞结构和组成简单易于原生质体化

4.原生质体能稳定的再生和增殖

5.可在琼脂培养基上进行增殖选择

6.具有可供选择的标记（如抗生素的耐性）第5页，课件共73页，创作于2023年2月细胞操作的全过程应保持在细胞的正常生理状态，这在再生和增殖阶段更为重要。需要注意的要点是：

1.处理前细胞状态的控制

2.处理过程细胞状态的控制，特别是外界条件如：温度、光照、盐度、PH、和处理时间等的控制

3.渗透压调节剂的种类和浓度

4.原生质体膜的稳定性

5、原生质体的纯化方法及纯度

6、不同研究目的的不同原生质体化程度。第6页，课件共73页，创作于2023年2月5.2海洋微藻的分离和纯化技术在以海洋为材料的的各种研究中，常常要求培养物是单种和无菌的。为实现这一目的，合适的分离和纯化技术是必需的。第7页，课件共73页，创作于2023年2月5.2.1藻的采集藻体的最初来源一般是采自自然环境。浮游藻可用浮游生物网采集和浓缩。附着的和丝状体种类可以从礁石、叶状体或其他大型藻类上刮取。当藻种采集后，必需在最短的时间内进行观察、鉴定和分离，应为有一些重要的微藻种类在几小时后可能开始解体。第8页，课件共73页，创作于2023年2月5.2.2分离方法1.毛细滴管复洗技术选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接20～30个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（1000～5000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。第9页，课件共73页，创作于2023年2月2.喷雾技术

相当简捷的技术，可用来分离和纯化采集的藻样。用离心洗涤法洗8~9ml藻样，最后离心一次后，在离心管中留2ml上清液，其余倒掉。将毛细管通过棉塞插到离心管的底部，将离心管固定于滴定台上。将压缩空气通过一滴管吹出并从离心管中的毛细管的顶端通过。离心管中的悬浮液会被吸出并形成细雾。将一灭菌的琼脂培养基平板迅速通过细雾，距离大约为25cm左右。盖好培养皿，至于合适的光照和温度下培养。经几天生长后，可用毛细滴管将没有细菌和真菌污染的单细胞或藻落挑出移入新鲜培养液中。第10页，课件共73页，创作于2023年2月3.琼脂板技术

将采集的少量藻与已冷却的但未凝固的含有营养物的琼脂培养液混合，搅匀后倒入培养皿，冷却凝固。在适宜条件下经几天培养后，将形成的藻落切下，再移入新鲜培养液中培养。第11页，课件共73页，创作于2023年2月5.2.3纯化方法1.离心洗涤技术

细菌和海藻一般可以较容易地通过离心和在无菌培养液中洗涤分开来。2.抗生素技术

用混合的抗生素可以成功地纯化海藻培养物，这一方法特别适用于那些较大的不适于离心洗涤的藻类。3.紫外光处理技术紫外光可用来处理纯化海洋微藻，因为大多数藻类对紫外线处理的致死效应比细菌的抗性强。第12页，课件共73页，创作于2023年2月4.过滤技术膜滤可用来分离丝状体海藻和细菌。5.纯化程度的检测

经纯化的培养物，应进行检测以确定培养物是否真正逮到了无菌，用一般性培养基做检测在不同温度和光暗条件下进行。第13页，课件共73页，创作于2023年2月5.3培养基成分及作用第14页，课件共73页，创作于2023年2月海水是海藻生长的理想介质，自然海水可以满足孢子萌发和不同藻种的分离等研究的需要，但在多数的培养中，用几种植物培养物如N、P、和Fe等加富海水是必要的。合成培养基的主要目的是提供简化的和确定的培养基。第15页，课件共73页，创作于2023年2月在配制培养基的过程中，一个主要的问题是海水培养基高压灭菌时会产生沉淀。目前，解决这一问题的途径主要有两个：

1.加入某种适宜且无毒的PH缓冲剂和螯合物，同时降低培养基的盐度，特别是钙的浓度。

2.用滤膜过滤的方法灭菌。第16页，课件共73页，创作于2023年2月用于藻类培养的培养基配方有很多种，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍几种比较常用的。水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见下表。第17页，课件共73页，创作于2023年2月第18页，课件共73页，创作于2023年2月以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。第19页，课件共73页，创作于2023年2月培养基的配制及其原则第20页，课件共73页，创作于2023年2月一、培养基母液的配制(一)母液配制的目的

1.方便配制其它的培养基：

2.保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取。

(二)母液配制方法

1.单配法将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。

2.混配法将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液，浓度可用amg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液aml。

第21页，课件共73页，创作于2023年2月（三）母液配制的药品与器材

1、药品：配制藻类培养基所需的药品、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL等。2、器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱等。第22页，课件共73页，创作于2023年2月（四）母液配制（以MS培养基为例）

无机大量母液铁盐母液第23页，课件共73页，创作于2023年2月配制MS培养基时母液的计算第24页，课件共73页，创作于2023年2月二、培养基的配制

海藻的培养基一般由三部分组成：大量元素、微量元素和维生素。配置步骤：无菌海水（600-700ml）

母液的量取溶解

液

调PH定容（1L）分装1.量取前先检查母液并摇动2.量母液前,移液管和量筒应润洗第25页，课件共73页，创作于2023年2月三、配制藻类培养基的原则

1、要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。

2、应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等

3、要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。

4、要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。

5、要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。

6、要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

第26页，课件共73页，创作于2023年2月MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。第27页，课件共73页，创作于2023年2月5.4海洋微藻的生长测量和培养技术第28页，课件共73页，创作于2023年2月5.4.1培养类型

海洋微藻的培养类型按时间长短分为：1.长期保存培养2.短期保存培养第29页，课件共73页，创作于2023年2月类型长期保存培养短期保存培养定义

指长时间保持一特定的海藻以备将来的使用的培养，能在长达3个月甚至1年的时间里保持藻的活力

指藻体材料用于实验前的较短时间的培养实验用法

一般不宜直接用于实验

可以直接用于实验培养基

营养琼脂培养基：如蛋白胨的Bold营养琼脂培养基,用于绿藻的长期保存培养获得正常微藻较低浓度培养基加速生长较高浓度培养基缺点（1）营养物必须是无菌的（2）某些藻在琼脂培养基上不能生长

不能长期保存第30页，课件共73页，创作于2023年2月5.4.2生长测定

1.分裂速率的计算

生长规律：慢——块——慢

生长指标：细胞数目适宜条件下，当生长速度达恒定时（指数生长期），细胞增加的速度与原来细胞数目之间有：第31页，课件共73页，创作于2023年2月表示在和时测得的细胞数。若用以2为底的对数来计算生长常数，则和这时k的意义为每天分裂的次数K（分裂次数/d）=Ke/ln2生长常数也可以用细胞加倍时间DT表示：DT=1/K=ln2/Ke第32页，课件共73页，创作于2023年2月2.细胞计数方法1）血球计数板计数法

血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3.计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,见图.第33页，课件共73页，创作于2023年2月计数方法：用酒精擦洗计数板取一滴藻液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室计数

1ml细胞数=1个大方格（0.1ul）细胞数×10×1000第34页，课件共73页，创作于2023年2月2)光密度法

原理：分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。方法:用分光光度计测得各浓度藻类的光度值，以细胞数为纵坐标，光度值为横坐标绘制细胞数和光度值的对应曲线。利用这一曲线，在测得样品的光度值后，可以查得样品的细胞数。

优点：计数快速方便第35页，课件共73页，创作于2023年2月5.4.1培养方法1.分批培养2.连续培养3.同步培养第36页，课件共73页，创作于2023年2月1.分批培养

分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量微藻种进行培养，使微藻生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的培养方法。是最简单和普遍采用的方法。单胞藻的生长可分为：生长延缓期：细胞刚开始适应环境，所以生长并不旺盛，生长曲线基本呈平线状指数生长期：细胞适应了环境，生长旺盛，生长速度极快，细胞数量呈倍数增长，生长曲线陡然上升静止期：因培养基营养物有限，而细胞此时数量已达很多，相互间竞争，所以死亡的细胞数和新生的细胞数持平，生长曲线再次呈平线。第37页，课件共73页，创作于2023年2月2.连续培养

指在一个限定的系统中，通过不断加入新鲜的营养液，在生长速度和稀释速度间建立一种平衡的关系，使培养液细胞浓度保持一定的培养方法。分为：（1）半连续培养：定期定量加入营养液，定期定量取出培养物。（2）全连续培养：不断加入营养液的同时营养液又不断流出。第38页，课件共73页，创作于2023年2月3.同步培养采取某种措施（变换光暗周期，温度和营养条件），使培养液中的藻类处于细胞周期中同一时期的培养方法。优点：每一周期均可得到细胞数目、干物质和细胞组成一致的材料同步培养的方法有诱导法和选择法两种。(一)诱导法

控制环境条件。诱导法就是采用物理、化学因子使微藻细胞生长进行到某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微藻细胞个体能进人下一生长阶段，待全部群体细胞都到达该生长阶段后，再除去该因子，使全部群体细胞同时进人下—个生长阶段，以达到诱导微藻细胞同步生长的目的。（二）选择法：用密度梯度离心或微孔滤膜，分离刚分裂的小细胞（体积和重量大致相等），然后再培养即可。第39页，课件共73页，创作于2023年2月5.5原生质体分离技术第40页，课件共73页，创作于2023年2月本节要点：原生质体与原生质球检测细胞壁存在的方法海藻原生质体的制备方法原生质体分离方法第41页，课件共73页，创作于2023年2月一.原生质体与原生质球

根据藻类细胞脱壁程度的不同，将脱壁后的藻细胞分为原生质体和和原生质球。原生质体：是指质膜外的细胞壁和包被层全部除去而保持其余细胞组分的任何基因型的藻细胞。原生质球是指细胞壁被全部或部分除去，仍保持质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分第42页，课件共73页，创作于2023年2月原生质体与原生质球的区别：

原生质球：细胞壁完全或部分去除，包被原生质球：细胞壁和包被层全部去除层完整保留。第43页，课件共73页，创作于2023年2月原生质体的特征：（1）无细胞壁障碍，可对膜、细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作。（2）具有全能性，能在人工条件控制下，进行大量，快速繁殖。（3）可诱导融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供实验材料。由于质膜外的包被层存在与否尚无标准的检测方法，故原生质体与原生质球间的差别常被忽略。第44页，课件共73页，创作于2023年2月二.检测细胞壁存在的方法电子显微镜细胞壁染色技术处理后的细胞对渗透胁迫的敏感性第45页，课件共73页，创作于2023年2月三.海藻原生质体的制备方法海藻原生质体的制备方法有机械法、微生物酶解法和酶法。机械法由于原生质体得率太低，费时费力目前已很少使用。微生物酶解法：利用海洋细菌与藻体共培养过程中释放出来的特殊酶，把海藻细胞壁分解掉从而得到原生质体，这实际也是酶法。酶法：是特定的酶水解藻细胞壁，具有很强的专一性，同时酶解的条件十分温和在细胞能够承受的范围之内，所以对细胞无伤害，而且酶法效率高从而能获得大量的有活力的原生质体。目前普遍采用酶解的方法第46页，课件共73页，创作于2023年2月（一）海洋微藻原生质体分离实例蓝藻（细胞壁含有粘肽），因而可以用溶菌酶消化的方法制备蓝藻的原生质体。绿藻（细胞壁含有纤维素），因而可用纤维素酶处理获得原生质体或原生质球。硅藻、甲藻（细胞壁结构特殊），可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理。红藻和褐藻可用多糖酶消化细胞壁成分制备原生质体。第47页，课件共73页，创作于2023年2月（二）原生质体制备的酶的来源微生物来源的海藻解壁酶。如从假单胞菌、产气单胞菌、弧菌、埃氏交替单胞菌、的发酵液或培养液中提取粗酶，这种粗酶可用于分离原生质体。微生物来源的海藻解壁酶有：琼胶酶、褐藻酸酶、卡拉胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶!紫菜聚糖酶。动物来源的海藻解壁酶。如从海兔中提取褐藻酸酶、从疣鲍中提取鲍酶、从紫海胆提取海胆酶、韩宝芹等，研究了14种无脊椎动物消化酶液对海藻的解壁作用，最终从滩栖螺、石鳖和笠贝中制备出海螺酶、石鳖酶和笠贝酶，并研究了这3种酶对4种绿藻、7种红藻和3种褐藻细胞的解壁作用。目前用于制备原生质体的酶类，如纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、离析酶等，已有商品出售。第48页，课件共73页，创作于2023年2月四.原生质体分离方法第49页，课件共73页，创作于2023年2月第50页，课件共73页，创作于2023年2月第51页，课件共73页，创作于2023年2月第52页，课件共73页，创作于2023年2月第53页，课件共73页，创作于2023年2月5.6原生质体的培养技术第54页，课件共73页，创作于2023年2月一、原理植物原生质体是除去细胞壁的一个为质膜所包围的的裸露细胞，用酶降解法脱去细胞壁的具有活力的原生质体，其在合适的离体培养条件下具有繁殖，分化，再生成为完整植株的能力。而动物本身没有细胞壁，自然不用去除细胞壁。第55页，课件共73页，创作于2023年2月二、实验仪器灭菌培养皿，血球计数板，显微镜，试管等。第56页，课件共73页，创作于2023年2月三、培养基液体再生培养基琼脂再生培养基第57页，课件共73页，创作于2023年2月四、实验过程稀释→离心沉淀→弃上清液→洗涤→悬浮→计数→光照→取原生质体→培养繁殖→再繁殖→再光照→藻落出现第58页，课件共73页，创作于2023年2月具有活力的原生质体在合适的培养条件下，3~6天就可以看见原生质体的第一次分裂，2周左右可见到小细胞团。要不断加入新鲜细胞培养基，加入的时间和容量按实验的情况而异，原则上要在原生质体一次或几次分裂后逐步再加入。

细胞团继续长大成愈伤组织到植株分化的过程与其它组织培养的情况相同。第59页，课件共73页，创作于2023年2月5.7细胞学技术第60页，课件共73页，创作于2023年2月一、破碎细胞的方法1.杆状玻璃匀浆器法该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力使玻杆移动使组织细胞破碎。第61页，课件共73页，创作于2023年2月2.高速组织捣碎机法使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中，至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖，固定好带杆叶片刀，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后，组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解，用冷却水降温更好。第62页，课件共73页，创作于2023年2月3.超声波处理法

超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。第63页，课件共73页，创作于2023年2月4.化学裂介法在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械去辅助，方可在短时间内