基因工程的原理和技术课件

DNAlinking-enzymerestrictionendonucleaseDNAlinking-enzyme利用基因工程原理让大肠杆菌生产人胰岛素又需要哪些基本操作步骤呢？1ppt精选版第二节基因工程的原理和技术基因工程（将人胰岛素基因转入大肠杆菌）胰岛素基因人体细胞大肠杆菌随细菌的增殖，胰岛素基因也同时复制胰岛素获取胰岛素基因的表达产物－胰岛素质粒大肠杆菌形成重组DNA分子导入受体细胞目的基因检测与鉴定获取目的基因2ppt精选版剪切拼接导入表达（一）获得目的基因（二）形成重组DNA分子（三）将重组DNA分子导入受体细胞（四）目的基因的检测和表达基因工程的基本操作步骤（技术）1、筛选含有目的基因的受体细胞2、目的基因的表达3ppt精选版问题：获取目的基因的方法有哪些？

思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，比如:如果我们对抗虫基因的碱基序列完全不知道，怎样从苏云金芽孢杆菌体内获取目的基因（抗虫基因）？

如何操作？

4ppt精选版大片段DNA打成许多小片段小片段DNA目的基因载入运载体细菌重组DNA分子重组DNA分子例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因如果运气不好，在打成小片段时，有可能把抗虫基因打断……基因组文库5ppt精选版如何从基因文库中获取目的基因?大片段DNA打成许多小片段小片段DNA目的基因载入运载体细菌重组DNA分子重组DNA分子基因组文库对基因组文库的所有细菌进行逐一筛查找出有抗虫蛋白的菌落该菌落所携带的基因片段就含有目的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因容易吗？6ppt精选版构建基因组文库，获取目的基因7ppt精选版一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库1.从基因文库中获取8ppt精选版思考：从基因组文库中获取人的胰岛素基因，导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？9ppt精选版思考：能否根据mRNA合成没有内含子的胰岛素基因？10ppt精选版单链RNA（mRNA)逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA逆（反）转录法合成目的基因：cDNA文库的构建RNA链DNA链水解RNA11ppt精选版一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库mRNA逆(反）转录目的基因(cDNA)形成重组DNA分子导入受体菌群体构建cDNA文库1.从基因文库中获取提取12ppt精选版13ppt精选版思考：基因文库如同国家图书馆，而cDNA文库则像某单位的图书馆，二者除了大小不同之外，还有哪些区别？小大无有无有部分基因全部基因思考：如果想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，需要构建哪一种基因文库？14ppt精选版问题：获取目的基因的方法有哪些？

思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？

15ppt精选版一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段导入受体菌群体构建基因组文库mRNA反转录目的基因(cDNA)导入受体菌群体构建cDNA文库目的基因的核苷酸序列是已知化学合成法目的基因1.从基因文库中获取2.化学合成法提取形成重组DNA分子形成重组DNA分子16ppt精选版问题：获取目的基因的方法有哪些？

思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？思考3：如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？

17ppt精选版思考：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛素基因的碱基序列？18ppt精选版化学合成法19ppt精选版一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库mRNA反转录目的基因(cDNA)形成重组DNA分子导入受体菌群体构建cDNA文库目的基因的核苷酸序列是已知化学合成法目的基因1.从基因文库中获取2.化学合成法提取或可推测的20ppt精选版问题：获取目的基因的方法有哪些？

思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？思考3：如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？思考4：如果我们知道目的基因两端的部分碱基序列，还可以怎样操作？21ppt精选版聚合酶链式反应（PCR技术）变性：双链DNA解链成为单链DNA复性（退火）：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链22ppt精选版双链DNA1.变性升温至95℃单链DNA2.复性降温至60℃引物与母链结合3.延伸升温至72℃DNA聚合酶解旋PCR技术与原理TaqDNA聚合酶有耐高温的特点23ppt精选版思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？聚合酶链式反应(PCR技术)扩增原理：目的：前提：条件：DNA复制获得大量的目的基因有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。模板DNA（目的基因）耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)四种脱氧核苷酸两种DNA引物24ppt精选版一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库mRNA反转录目的基因(cDNA)形成重组DNA分子导入受体菌群体构建cDNA文库目的基因的核苷酸序列是已知化学合成法3.利用PCR技术扩增目的基因1.从基因文库中获取2.化学合成法提取获取大量目的基因或可推测的25ppt精选版第一个循环第二个循环第三个循环最快第几轮能得到目的基因？26ppt精选版DNA分子目的基因解旋酶高温（加热至95℃）RNA引物DNA引物解旋酶、DNA聚合酶等TaqDNA聚合酶27ppt精选版人工基因合成法DNA合成仪PCR扩增仪28ppt精选版一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因问题：怎样将目的基因与质粒进行重组？29ppt精选版质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA30ppt精选版同一种限制酶切割质粒外源基因重组DNA分子（重组质粒）DNA连接酶31ppt精选版32ppt精选版33ppt精选版问题2：形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使目的基因在受体细胞中表达和发挥作用，需要对重组质粒作怎样的修饰？据图回答：一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有哪些基本元件？34ppt精选版(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)基因表达载体的组成启动子目的基因终止子复制起点标记基因一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子（基因表达载体）。35ppt精选版用BamHⅠ对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？36ppt精选版含目的基因的DNA片段载体BamHⅠBamHⅠ

DNA连接酶重组体载体自连目的基因自连37ppt精选版

双酶切连接：思考：如何避免质粒和目的基因的自身环化？1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接2、提高重组DNA分子的重组率38ppt精选版(三)将目的基因导入受体细胞(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因常用的受体细胞：

有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。39ppt精选版重组质粒大肠杆菌的拟核目的基因氨苄青霉素抗性基因（标记基因）将细菌用CaCl2处理，使细胞处于感受态，可促进细胞吸收DNA分子如果是导入微生物（如细菌）40ppt精选版

感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。处于感受态的细胞称为感受态细胞.CaCl20℃重组载体感受态细胞42℃如果是导入微生物（如细菌）41ppt精选版(三)目的基因导入受体细胞1.转基因微生物重组DNA分子(基因表达载体)CaCl2处理感受态细菌细胞(工程菌)

目的基因随受体细胞的繁殖而复制增大细胞壁通透性(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因吸收DNA分子重组DNA进入细菌细胞42ppt精选版如果是导入动物细胞显微注射仪受精卵思考：培育转基因动物时，受体细胞能否采用动物体细胞？试说明理由。一般可以采用动物的什么细胞？用口径为1μm的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。43ppt精选版(三)目的基因导入受体细胞1.转基因微生物重组DNA分子(基因表达载体)CaCl2处理感受态细菌细胞(工程菌)

目的基因随受体细胞的繁殖而复制增大细胞壁透性2.转基因动物重组DNA分子显微注射受精卵或早期胚胎细胞(整合到染色体DNA上)转基因动物动物细胞培养胚胎移植(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因吸收DNA分子重组DNA进入细菌细胞或病毒侵染44ppt精选版思考：1、如果是导入植物细胞，最好以什么细胞为受体细胞？一般采用的运载体又是什么？2、比如：培育抗虫棉，怎样操作才能成功导入？45ppt精选版农杆菌转化法农杆菌的Ti质粒T-DNA：(可转移的DNA）可转移（也可以将目的基因转移）至受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。46ppt精选版农杆菌转化法47ppt精选版3.转基因植物重组DNA分子农杆菌植物体细胞(整合到细胞染色体DNA上)侵染植物组织培养转基因植物农杆菌转化法48ppt精选版利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒（有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um）表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本太高。基因枪49ppt精选版花粉管卵细胞花粉管通道法受精后

花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。50ppt精选版3.转基因植物重组DNA分子农杆菌植物体细胞(整合到细胞染色体DNA上)侵染植物组织培养转基因植物基因枪或花粉管通道法农杆菌转化法51ppt精选版(三)目的基因导入受体细胞(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因(四)目的基因的检测与鉴定问题1：根据中心法则，目的基因怎样表达？成功表达的标志是什么？52ppt精选版按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了mRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测个体是否具有目的基因所对应表现型如何检测？53ppt精选版思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？54ppt精选版没有质粒含目的基因的质粒正常质粒55ppt精选版没有质粒含目的基因的质粒正常质粒56ppt精选版DNA分子杂交法检测目的基因57ppt精选版DNA分子杂交法制作方法：化学合成或PCR法合成特点：1.被放射性同位素标记2.目的基因片段3.单链DNA原理：碱基互补配对，检测未知DNA分子用途：目的基因检测,DNA指纹,亲缘关系测定,基因诊断。DNA分子探针法58ppt精选版检测转基因生物体内是否已含有目的基因同理：

核酸分子杂交技术按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关思考：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基因完成了表达吗？检测目的基因是否已转录出了mRNA59ppt精选版检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了mRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质利用抗原--抗体的特异性结合按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关问题：如何运用抗原抗体特异性结合的原理检测目的基因是否翻译出了蛋白质？60ppt精选版检测目的基因是否已翻译出了蛋白质利用抗原--抗体的特异性结合将目的基因表达出的蛋白质作为抗原制备抗体61ppt精选版检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了mRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测个体是否具有目的基因所对应表现型按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关问题：除了上述分子检测外，你能否在个体生物学水平上进行检测？例如，如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性？62ppt精选版转基因抗虫植物用棉花叶片饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。63ppt精选版(四)目的基因的检测与鉴定1.目的基因是否导入：(1)标记基因检测法。(2)DNA分子杂交法(DNA探针检测法)2.目的基因是否表达：(3)是否出现目的基因所控制的性状:(2)是否翻译合成了蛋白质：

抗原抗体杂交检测法核酸分子杂交法（1）是否转录出了信使RNA：观察法64ppt精选版65ppt精选版基因工程的基本操作程序基因文库获取目的基因基因组文库cDNA文库化学合成法PCR扩增法运载体（细菌质粒）酶切、连接，构建重组DNA（基因表达载体）受体细胞导入筛选动物受精卵植物体细胞细菌细胞组织培养发酵工程胚胎移植表达产物转基因动物转基因植物目的基因的表达与鉴定总结：66ppt精选版二.基因工程的原理1.整体原理：人工的基因重组2.各步骤原理：（1）基因能转移：基因是独立的遗传单位（2）不同生物的基因能拼接：不同生物的DNA有着相同的双螺旋结构和碱基互补配对原则，限制酶和连接酶的作用。（3）同一基因在不同生物的细胞中合成相同的蛋白质：复制、转录和翻译过程相同，密码子具有通用性3.优点：定向改变生物的遗传特性67ppt精选版例1

科学工作者分离得到了某真核生物的基因A，将其解离成两条具有互补关系的单链，其中的一条与基因A的信使RNA进行配对，杂交后可以观察到如图所示的结构．对此结果的合理解释是（）A．1、3、5、7为DNA/RNA的杂交体，2、4、6为单链DNA部分B．1、3、5、7为DNA/RNA的杂交体，2、4、6为单链RNA部分C．1、3、5、7为双链DNA部分，2、4、6为DNA/RNA的杂交体D．1、3、5、7为单链RNA部分，2、4、6为DNA/RNA的杂交体A68ppt精选版例2.质粒是基因工程中最常用的运载体，质粒上有标记基因（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同。右图表示外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请据下表细菌生长情况，推测①②③三种重组细菌与外源基因插入点相对应的一组是

A．①是c、②是a

、③是b

B．①是c和b、②是b、③是cC．①是c和b、②是c、③是b

D．①是a、②是b、③是cbacAbca69ppt精选版例3.培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程.

抗虫基因含kan质粒重组质粒土壤农杆菌含重组质粒土壤农杆菌A构建C诱导选择导入转基因抗虫植株再生植株愈伤组织离体棉花叶片组织侵染B培养选择分化D检测（1）A过程需要的酶有_______________________。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是_____________________________。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入____________。限制性核酸内切酶和DNA连接酶能够自我复制、具有标记基因卡那霉素70ppt精选版4.如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用__________________作为探针。

5.科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。①将转基因植株与___________________杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。②若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为________。③若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占____________%。标记的目的基因非卡那霉素敏感型3:110071