浙大生化实验报告氨基转换反应

专业： 生.环 渺f渺f■博实验报告学号： 日期：2013.12.03地点：—课程名称： 生.化实验甲指导老师: 成绩：实验名称：氨基移换反应及其产物的鉴定实验类型:同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、 学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理；2、 学习纸层析的原理和操作技术。二、实验基本原理氨基移换反应：在氨基移换酶（转氨酶）的催化下，氨基酸的a-氨基和a-酮酸的a-酮基之间发生的互换反应。转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,GPT）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性较高。GPT催化下的转氨基反应为：COOH COOH COOH COOHCOOH COOH丙氮酝 A酣戊二酸 丙酣酝 谷氢醴L一谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L一谷氨酸氧化脱一NH2,加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L一谷氨酸。本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和a一酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT）的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。纸层析原理：滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。茚三酮的显色原理： d .氨基酸+茚三酮类 “口'二紫红色复合物三、 实验材料与试剂1、 实验材料动物肝脏（牛蛙肝或猪肝）2、 实验试剂⑴0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）；⑵0.1mol/La-丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）；⑶0.1mol/La-酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）；⑷0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）；⑸展层溶剂一酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）；⑹10%三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）；⑺0.25%碘乙酸（抑制L-谷氨酸脱氢酶活性）；⑻显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。四、 实验器材与仪器⑴研钵；⑵试管及试管架；⑶恒温水浴箱（37°C、100°C）；⑷铅笔、尺和圆规；⑸毛细管（直径0.5mm）；⑹新华定性滤纸（直径11cm）；⑺剪刀和镊子；⑻电吹风；⑼滴管；⑽康氏皿；（11） 喷雾器；（12） 烘箱（80C）。五、 实验操作方法和步骤1、 转氨酶液的制备取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。2、 氨基移换反应取4支洁净、干燥的试管，按下表操作

管号试剂、操作1234转氨酶提取用〔祖）11110.25!&碘乙酸(ml)0.50.50,50.5预温滴加10%三氯乙酸溶液2滴,LOOlXSinin置371C恒温水浴保温血也0.Irool/L。一丙氨酸pH7.4(ml)1110.lwl/La一同戊I酸 4(ml)111磷酸缓冲液pH?.4 （ml）1221酶促反应混匀，置3TC恒温水浴保g40min（经常擂动）终止酶反应滴加10%三氯乙咬溶液2滴，置]00CC恒温水洛保温施访3、层析⑴准备：取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm）。另取2cmX3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。用铅竿尖在园心处截一H珀.5.5cm用铅竿尖在园心处截一H珀.5.5cm瞬笔作出瓶样隘⑵点样：用毛细管依次点标准a一丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）各点2次，其余1—4号管样液各点2〜3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。—1号管反应样波（«-丙氨酸）—2号管反应样液（a-丙氨殖）—3号管反应样液号管反应样液（«-丙氨酸•谷巍酸）样液二爪-丙氨醯准样裴：谷氧酸⑶展层、显色（4）预计结果虱果散杵品的分麻图诰将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中，平放在盛有展层溶剂的康氏皿中，使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中，再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散，待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm（约需半小时），取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮一乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘（4）预计结果虱果散杵品的分麻图诰六、结果分析由实验结果可知，1与3所点的样显然受到了谷氨酸的污染，原因可能为：1、点样的时候用的毛