分子生物学实验步骤总结超全

分子生物学实验步骤总结超全

获取一目的基因的方法细菌基因组DNA提取的实验步骤需要以下仪器和试剂：仪器：1.台式高速离心机2.恒温水浴箱3.枪式移液器4.灭菌的EP管和Tip头试剂：1.溶液1：包括25%蔗糖、50mmol/LTris-Hcl(pH8.0)、50mmol/LEDTA(pH8.0)、500ug/ml溶菌酶（现用现配）和100ug/mlRNase。2.溶液Ⅱ：包括100mmol/LTris-Hcl(pH8.0)、1%SDS和400ug/ml蛋白酶K。3.酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4.氯仿：异戊醇（24：1）5.3mol/LNaAc(pH5.2)6.异丙醇或无水乙醇7.70%乙醇8.TE缓冲液：包括10mmol/LTris-Hcl(pH8.0)和1mmol/LEDTA(pH8.0)实验步骤：1.用5mL细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。2.将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。3.加入250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。4.加入0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的EP管，重复步骤4一次。5.向转移的水相中加入0.9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的EP管，重复步骤5一次。6.向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。7.14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。8.将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。9.进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。另一种提取植物DNA的方法是SDS提取法，需要以下试验试剂：1.研磨缓冲液：包括59.63gNaCl、13.25g柠檬酸三钠、37.2gEDTA－Na，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2.10SSC溶液：包括87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3.1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4.0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。以上是SDS提取法的试剂和步骤。1.制备浓缩液和使用液浓缩液50×的配方为242gTris，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)，最后定容至一升。使用液1×的配方为4.84gTris，1.15ml冰乙酸，2ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)，最后定容至一升。2.样本液样本液的配方为10×缓冲液，包括60%蔗糖和0.4%溴酚蓝。3.实验步骤1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。2）制备0.8%琼脂凝胶板，取0.6g琼脂糖加80mlTAE(1×)，20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°C-65°C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE(1×)，使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。4）将DNA样品按照10：1的比例加入样本液，混匀后用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。4.技术要点1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。2）电泳中注意防止凝胶发热。3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。4）操作时注意防护，因为溴化乙锭有强烈的致癌作用。五、目的DNA的回收纯化1.仪器1）琼脂糖凝胶电泳系统2）凝胶成像仪3）离心机4）单面刀片5）恒温水浴锅2.试剂1）DNA回收试剂盒2）50×TAE3）ddH2O3.实验步骤详见DNA回收试剂盒的说明书。实验材料包括DH5α大肠杆菌、灭菌玻璃平皿、灭菌锥形瓶、灭菌离心管、刻度吸管、冰盒、移液器、灭菌Eppendorf管等。实验步骤如下：首先从－70℃保存的高效转化菌种中取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时；然后挑取单菌落接种于无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；接着按照1:100接种菌液至LB培养基中，37℃剧烈振荡培养1.5-2小时左右，至OD600达0.4-0.6；将菌液冰浴10分钟，转移至预冷的离心管中离心10分钟；弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的0.1MCaCl2中，冰浴20分钟，离心10分钟；弃尽上清，以预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50μL在冰上分装，－80℃保存；取连接产物2μl置于冰上；从－80℃冰箱取3管感受态细菌（每管50μl），在冰上融化；将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上20－30分钟；同时做两个对照管：受体菌对照和质粒对照；42℃加热90秒，迅速置于冰上1－2分钟；每管加入400－1000μl的无抗生素液体LB培养基，在37℃摇床缓慢摇荡20－60分钟；用<10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μl并用移液器吹吸重悬细菌；取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性的LB琼脂糖平板上，倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。技术要点包括：加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％；42℃热激时，必须要保证温度的准确性；涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。9)将细菌沉淀离心10000rpm，10分钟后弃去上清液，加入1ml70%乙醇。不要混匀，再次离心10000rpm，5分钟后重复加入1ml70%乙醇，弃去上清液，然后将样品放入干燥箱中干燥。10)干燥后，加入30μlTE（含RNA酶A10ul，20μg/ml），使质粒溶解，然后将样品保存在-20°C中备用。11)取一个灭菌的EP管，依次加入下列试剂：10×限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O11.0ul、限制性内切酶2.0ul，总体积为20.0ul。12)将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，然后将样品放入37°C水浴保温3-4小时。酶切结束时，加入0.5mmo