色谱分析导论

色谱分析

郭方遒

参考书1.色谱学导论，达世禄编著。武汉：武汉大学出版社，19992.现代色谱分析:张祥民20043.色谱理论根底，卢佩章等著。北京：科学出版社，19964.色谱分析概论，傅假设农编著。北京：化学工业出版社，20055.高效液相色谱方法与应用，于世林编著。北京：化学工业出版社，2005甘肃等地报告多例婴幼儿泌尿系统结石病例，调查发现患儿多有食用三鹿牌婴幼儿配方奶粉的历史。三聚氰胺〔cyanuramide〕，分子式C3H6N6过去认为，三聚氰胺被认为毒性轻微。但去年年美国宠物非正常死亡事件彻底改变了人们对三聚氰胺毒性轻微的观点。调查结果认为：掺杂了≤6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因，也就为它毒性轻微的结论画上了问号不法者在食品中渗三聚氰胺的动因：主要是由于其分子中含有大量氮元素。用普通的全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质数值时，根本不会区分这种伪蛋白氮。添加在食品中，可以提高检测时食品中蛋白质检测数值。

目前通用的3种“三聚氰胺〞的检测方法——高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法，第一章色谱分析导论

一、色谱法开展俄国植物学家茨维特在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后参加石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相别离形成各种不同颜色的谱带。1906年他命名这种方法为色谱法(Chromatography)。以后此法逐渐应用于无色物质的别离，“色谱〞二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。第一节概述1906Tswett把这种别离方法命名为色谱法。遗憾的是这一对科学事业作出的重要奉献，竟被遗忘了25年。

1941年，马丁和辛格〔MartinandSynge〕用成功的别离了氨基酸，建立了液液色谱分析方法，因此获得了1952年诺贝尔化学奖

1952年，马丁和辛格〔MartinandSynge〕创立了气液色谱法，提出了塔板理论

1957年，戈雷〔Golya〕创造毛细管GC柱

1959年，GPC色谱

1967年，HPLC

近年，毛细管电泳的兴起，为生物大分子的别离检测开辟了一条新途径发表色谱文献的主要期刊

1、JournalofChromatography，A

2、JournalofChromatography，B

3、ThejournalofMicrocolumnSeparation

4、Chromatographia

5、JournalofChromatographyScience

6、JournalofHighResolutionChromatography

7、LC•GC

8、Analyst

9、TrendinAnalyticalChemistry

10、AnalyticalChemistry

11、AnalyticalChemistryActa

12、JournalofAnalyticalandAppliedPyrolysis

14、分析化学

15、色谱

16、分析测试通报

17、分析科学学报

18、分析仪器

有关气相色谱的国际互联网网址精选

1、://dir,yahoo/science/chemistry/chromatography(色谱网址目录)

2、members.aol/cic4urgc/related.htm(链接多家色谱公司的网址)

3、://(安捷伦科技公司)

4、://(中国安捷伦科技公司)

5、://(日本岛津公司)

6、://(瓦里安公司)

7、(PE公司)

8、member.aol/cic4urge/index.htm(AOL公司)

9、://-ed/sep(别离科学，气相色谱)

10、://(荷兰Elsevier出版公司，如Anal．Chim．Acta，J．Chromatogr．A，J．Chromatogr．B，Chromatographia等)

11、://(化学网站)

12、://(气相色谱培训班)

13、://(各种别离技术)

14、://(色谱理论)

15、://(气相色谱根底)

16、://(毛细管气相色谱)

17、://(气相色谱研究和应用)

18、://(色谱仪器)

19、://(色谱仪器)

岛津,安捷伦,Waters国内生产GC山东鲁南瑞虹,金普分析仪器

北分天普国内生产HPLC的主要有大连依利特、上海伍丰、大连江申、温州福立、山东鲁南上海天美上分北分、上海通微、北京创新通恒等

但大局部是OEM产品，是委托国外生产的，真正原创的不多，市场上销售较多的就是上海伍丰、大连依利特，而且已经经受了时间的考验。

二、色谱分析的特点和优点1.特点：高超的别离能力2.优点：别离效率高；应用范围广；分析速度快；样品用量少；灵敏度高；别离和测定一次完成；易于自动化。应用的领域:生命科学,材料科学,环境科学药学(药物分析):各国药典收载了许多色谱分析方法.中国药典2部,700多,纯度检验,定性鉴别和含量测定.一部,600多,定性鉴别和含量测定气相色谱应用领域以及有关分析实例

一、

应用领域：

1、

石油和石油化工分析：

油气田勘探中的化学分析、原油分析、炼厂气分析、模拟蒸馏、油料分析、单质烃分析、含硫/含氮/含氧化合物分析、汽油添加剂分析、脂肪烃分析、芳烃分析。

2、

环境分析：

大气污染物分析、水分析、土壤分析、固体废弃物分析。

3、

食品分析：

农药残留分析、香精香料分析、添加剂分析、脂肪酸甲酯分析、食品包装材料分析。

4、

药物和临床分析：

雌三醇分析、儿茶酚胺代谢产物分析、尿中孕二醇和孕三醇分析、血浆中睾丸激素分析、血液中乙醇/麻醉剂及氨基酸衍生物分析。

5、

农药残留物分析：

有机氯农药残留分析、有机磷农药残留分析、杀虫剂残留分析、除草剂残留分析等。

6、

精细化工分析：

添加剂分析、催化剂分析、原材料分析、产品质量控制。

7、

聚合物分析：

单体分析、添加剂分析、共聚物组成分析、聚合物结构表征/聚合物中的杂质分析、热稳定性研究。

8、

合成工业：

方法研究、质量监控、过程分析。

二、

分析实例：

〔一〕

天然气常量分析：

选用热导检测器，适用于城市燃气用天然气O2、N2、CH4、CO2、C2H6、C3H8、i-C40、n-C40、i-C50、n-C50等组分的常量分析。分析结果符合国标GB10410.2-89。

〔二〕

人工煤气分析：

选用热导检测器、双阀多柱系统，自动或手动进样，适用于人工煤气中H2、O2、N2、CO2、CH4、C2H4、C2H6、C3H6等主要成分的测定。分析结果符合国标GB10410.1-89。

〔三〕

液化石油气分析①：

选用热导检测器、填充柱系统、阀自动或手动切换，并配有反吹系统，适用于炼油厂生产的液化石油气中C2-C4及总C5烃类组成的分析〔不包括双烯烃和炔烃〕。分析结果符合SH/T10230-92。

液化石油气分析②：

选用热导检测器，填充柱系统、阀自动或手动切换，并配有反吹

系统，适用于液化石油气中C5以下气态烃类组分的分析〔不包括炔烃〕。分析结果符合GB10410.3-89。

〔四〕

炼厂气分析：

选用热导和氢焰离子化检测器，填充柱和毛细管柱别离，通过多阀自动切换，信号自动切换，实现一次进样，多维色谱分析，快速分析H2、O2、N2、CO2、CO、C10-C60、C2二-C4二及C6以上烃等组分。分析结果重复性好、操作方便，完全可以与国外进口仪器相比。

〔五〕

车用和航空汽油中苯及甲苯分析：

选用热导检测器或氢焰离子化检测器，双柱串联，通过阀自动切换，并配有反吹系统，实现一次进样完成对汽油中苯及甲苯的定性及定量分析。分析结果符合国标GB17930-1999。

〔六〕

汽油中某些醇类和醚类分析：

选用氢焰离子化检测器，多柱系统，十通阀自动切换和反吹，一次直接进样分析汽油中某些醇类和醚类。特别适用于车用和航空汽油以及含乙醇的汽油中有关醇、醚的分析。参见部级标准SH/T0663-1998。

〔七〕

蒸馏酒及配制酒卫生标准的气相色谱分析：

采用氢焰离子化检测器，GDX-102填充柱或FFAP大口径毛细管柱，外标法〔峰面积〕定量，分析白酒中的甲醇和杂醇油。分析结果完全符合国标。

〔八〕

食品用酒精采用PEG-20M毛细管柱，采用FID检测器，内标法完成对优质食用酒精中甲醇、杂醇油等微量组分的检测。分析结果完全符合国标GB10343-2002的要求。

〔九〕

白酒中有关醛、醇、酯的分析：

采用氢焰离子化检测器，使用20%DNP+7%吐温-80，或兰州化物所大口径￠0.53mm专用毛细管柱，完成浓香型白酒和清香型白酒中主要的醇、醛、酸、酯各个组分的分析。使用毛细管柱除提高了分析效率外，还能检出有机酸，为复杂的酿造发酵工艺提供了更多有价值的信息。分析结果完全符合国标GB10345.7-89/GB10345.8-89。

〔十〕

植物油中残留溶剂的检测：

可以按照国标GB/T5009.37-2003顶空气相色谱法对浸出油中6号溶剂残留量进行测定。采用氢焰离子化检测器，内装涂有5%DEGS固定液的填充柱，外标法标准曲线定量。也可以采用DJ-200型顶空进样器〔可以放置6个顶空瓶，顶空瓶规格：2、10、20ml任选〕。采用顶空进样器确保了分析的可靠性，提高了分析效率，可加热的气密针套，确保样品无稀释、无冷凝。

〔十一〕室内空气检测分析：

选用氢焰离子化检测器，配以热解吸进样器、填充柱或毛细管柱，按国标GB50325-2001选用专用的色谱柱可完成对室内空气中苯、甲苯、二甲苯及总挥发性有机合物〔TVOC〕的检测。采用衍生气相色谱法，经2.4-二硝基苯肼衍生，用环已烷萃取，以OV-17和QF-1混涂色谱柱别离，用电子俘获检测器〔ECD〕测定室内空气中的甲醛，与用比色法测定甲醛相比，具有灵敏、准确、无干扰、试剂易保存等优点。

〔十二〕变压器油裂解产物气相色谱分析：

采用氢焰离子化检测器和热导检测器，Ni触媒转换器、六通阀自动切换，无二次分流系统，使之对变压器油裂解产物〔8种组分气体〕一次进样全自动分析，定量准确、灵敏度高。微机控制可实现FID/TCD的输出信号自动切换。

可以选用振荡脱气的取样方式，也可以采用外购自动顶空进样器自动进样。分析结果完全符合国标GB7252-2001。

〔十三〕食品添加剂及食品中农药残留分析:

选用不同种类的检测器和色谱柱可完成对食品中山梨酸、苯甲酸〔GB/T5009.29-2003〕、食品中有机磷农药残留〔GB/T5009.20-2003〕、食品中六六六、滴滴涕残留〔GB/T5009.19-2003〕、食品中氨基甲酸酯农药残留〔GB/T5009.145-2003和GB/T5009.104-2003〕、食品中拟除虫菊酯农药残留，用于植物性食品〔GB/T5009.110-2003〕和动物性食品〔GB/T5009.162-2003〕。海产品中多氯联苯的气相色谱法〔GB/T5009.190-2003〕。食品中氯丙醇的检验，可采用三氯乙酐衍生化结合电子俘获检测器〔ECD〕进行测定。参考GB/T14551-93，选用电子俘获检测器，配以毛细管进样系统和专用大口径毛细管柱，可完成对茶叶中有机氯农药残留的检测。

〔十四〕烟草及烟草制品检测分析：

选用TCD、FID，配以专用色谱柱，可完成对烟气总粒相物中水份及尼古丁含量的检测，其方法是国际上普遍采用的一种快速、准确、先进的测试方法。对烟草、烟草制品中有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等农药残留的测定，可采用ECD、FPD、NPD检测器配以不同的毛细管柱来完成。可参考国标GB/T13595-2004和GB/T13596-2004。

〔十五〕其它：

除以上分析外，配合静态顶空进样装置可以完成血液中乙醇含量的测定以及药品中残留溶剂的分析。利用固相微萃取装置与顶空技术可以实现食品中的气味分析。利用吹扫-捕集进样技术实现废水中挥发性芳烃的分析以及饮用水中挥发性有机物分析。PTV-GC/ECD、NPD同时测定环境水中多种农药残留的色谱分析。

对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大〔大于400以上〕的有机物〔这些物质几乎占有机物总数的75%～80%〕原那么上都可应用高效液相色谱法来进行别离、分析。据统计，在化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。1、环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶〔37～50mm〕流动相：正己烷流速：1.5ml/min色谱柱：50cm×2.5mm〔内径〕检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2、稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇；线性梯度淋洗，2%/min流速：1ml/min柱温：50℃柱压：70×104Pa检测器：紫外检测器三、色谱分析的根本概念及分类在色谱法中，将静止不动的一相〔固体或液体〕称为固定相；自上而下运动的一相〔一般是气体或液体〕称为流动相；装有固定相的管子〔玻璃管或不锈钢管〕称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。可完成这种别离的仪器即色谱仪。从不同角度，可将色谱法分类如下：1.按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱〔GC〕根据固定相是固体吸附剂还是固定液〔附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体〕，又可分为气固色谱〔GSC〕和气液色谱〔GLC〕。液体为流动相的色谱称液相色谱〔LC〕同理液相色谱亦可分为液固色谱〔LSC〕和液液色谱〔LLC〕。在液相柱色谱中有正相、反相、离子和离子对色谱等多种模式。还有一些其他液相色谱模式：纸色谱、薄层色谱、体积排阻色谱、超临界流体〔SFC〕、电色谱等。2.按别离机理分类利用组分在吸附剂〔固定相〕上的吸附能力强弱不同而得以别离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液〔固定相〕中溶解度不同而到达别离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂〔固定相〕上的离子交换能力不同而到达别离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而到达别离的方法，称为凝胶色谱法或体积排阻色谱法。利用电渗析淌度差异——毛细管电泳。毛细管电泳又可分为五种模式(毛细管区域电泳，毛细管凝胶电泳，毛细管胶束电动色谱，毛细管等电聚焦，毛细管等速电泳)。还有用电压和泵同时驱动的电色谱。利用不同组分与固定相〔固定化分子〕的高专属性亲和力进行别离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的别离。3.按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。4.按使用领域不同可分为：1.分析用色谱仪又可分为实验室用色谱仪和便携式色谱仪。这类色谱仪主要用于各种样品的分析，其特点是色谱柱较细，分析的样品量少。2.制备用色谱仪又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪。制备型色谱仪可以完成一般别离方法难以完成的纯物质制备任务，如纯化学试剂的制备、蛋白质的纯化。3.流程色谱仪在工业生产流程中为在线连续使用的色谱仪。目前主要是工业气相色谱仪，用于化肥、石油精炼、石油化工及冶金工业中。第二节色谱学根本概念2-1色谱过程各种色谱方法的共同特点是：1色谱别离体系都有两个相，即流动相和固定相；2色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对运动，流动相渗滤(percolation)通过固定相；3被别离样品各组分，在色谱分析中称为溶质，与流动相和固定相具有不同作用力，一般为分子、离子间作用力。色谱过程系多组分混合物在流动相带动下通过色谱固定相，实现各组分别离。样品在色谱体系或柱内运行有两个根本特点：一是混合物中不同组分在柱内的差速迁移(differentialmigration)；二是同种组分分子在色谱体系迁移过程中分子分布离散(spreading)。组分通过色谱柱的速度，取决于各组分在色谱体系中的平衡分布。因此，影响平衡分布的因素，即流动相和固定相的性质、色谱柱温等影响组分的迁移速度。色谱过程的分布离散是指同一化合物分子沿色谱柱迁移过程中发生分子分布扩展或分子离散。同一组分分子在色谱柱入口处分布在一个狭窄的区带内，随着分子在色谱柱内迁移，分布区带不断展宽，同种组分分子的迁移速度不同，这种差异不是由于平衡分布不同，而是来源于流体分子运动的速率差异。2-2色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起局部就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线〔吸附色谱〕或分配等温线〔分配色谱〕的线性范围内，那么色谱峰是对称的，可用Gauss正态分布函数表示。色谱图通常具有下面根本特征：1在适当的色谱条件下，样品中每个组分均有相应的色谱峰，色谱峰一般呈对称的Gaussian曲线2色谱峰的区域宽度与组分的洗出时间(即保存时间)一般呈线性关系．峰半高宽度或峰底宽度随组分保存时间呈线性增加(图)。如果连续的色谱峰其中一个峰的半高宽度不规那么增大，那么可能该色谱峰中有一个以上组分。图:色谱峰区域宽度与保存时间呈线性关系

式中：C—不同时间t时某物质的浓度，C0—进样浓度，tr—保存时间，σ—标准偏差。〔一〕基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。〔二〕峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以〔h〕表示。〔三〕保存值1.死时间t0不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如以下图。信号进样t0时间因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0的比值计算，即ū=L/t02.保存时间tr试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保存时间，如以下图。信号进样tr时间3.调整保存时间tr´某组分的保存时间扣除死时间后，称为该组分的调整保存时间，即tr´=trt0由于组分在色谱柱中的保存时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr´实际上是组分在固定相中保存的总时间。保存时间是色谱法定性的根本依据，但同一组分的保存时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保存体积来表示保存值。4.死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。在气相色谱中，当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco〔cm3·min-1〕计算。V0=t0Fco式中Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。

5.保存体积Vr指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保存时间与保存体积关系：Vr=trFco6.调整保存体积Vr某组分的保存体积扣除死体积后，称为该组分的调整保存体积。Vr=VrV0=trFco7.相对保存值(relativeretention)在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准〔s〕，然后再求其它峰〔i〕对这个峰的相对保存值，此时可用符号表示，即=tr(i)/tr(s)式中tr(i)为后出峰的调整保存时间，所以总是大于1的。相对保存值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子或别离因子。由于相对保存值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。8保存指数(retentionindex)作为色谱定性数据，相对保存值有一个根本缺点，即不可能固定一个标准物。对一个多组分的复杂混合物，由于保存值差异很大，用一个标准物准确测定各组分相对保存值有困难，因而，已发表的色谱文献涉及到不同标准物，使相对保存值的应用受到限制。在气相色谱领域，1958年Kovats提出用正构烷烃系列作为度量被测物质的相对保存值的标准。根据同系物调整保存时间的对数与碳原子数呈线性关系：定义正构烷烃的保存指数为100n，如正戊烷、正己烷、正庚烷的保存指数分别为500,600,700。被测物质的保存指数用适当的正构烷烃的保存值表示。欲测定某组分x的保存值时，选取两个相邻的正构烷烃作标准物．其中一个碳数为n，另一个为n+1，组分保存值恰处于两个烷烃之间：标准物也可选碳原子数相差n的两个正构烷烃，其通用计算公式：

(四)区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。1.标准偏差

即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽W1/2

即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为：W1/2=2.3543.峰底宽度W

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是：W=4从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保存值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保存值及其区域宽度，是评价色谱柱别离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相〔或流动相〕选择是否适宜的依据。第三节色谱学根底理论色谱分析的目的是将样品中各组分彼此别离，组分要到达完全别离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。它包括三个根本理论问题：①色谱过程热力学：色谱别离的第一个条件是两相邻组分保存值存在一定差异，洗出两个色谱峰具有足够远的距离。溶质、流动相、固定相的分子结构和溶质与固定相、流动相之间的分子作用力及分布平衡常数与色谱保存值的关系，即分子结构与保存值关系及溶质在各种色谱条件下保存值的变化规律是色谱热力学研究的主要课题；它是开展高选择性色谱体系，探讨色谱别离机理、评价色谱固定相、流动相，建立色谱定性方法的理论根底。2色谱过程动力学：色谱别离的第二个条件是色谱峰区域宽度要窄。色谱峰的宽窄与溶质在流动相和固定相的连续重复分配过程中流体分子扩散、传质等有关，色谱别离过程流体分子运动规律是色谱动力学的研究课题。它是开展高效色谱柱和色谱方法的理论根底。③色谱别离理论：色谱实际别离既要求各组分保存值差异足够大，也要求色谱峰窄；而改变色谱条件两者均发生变化，即别离度随色谱条件变化．在解决多元混合物别离问题时，不仅要求各组分间到达一定别离度，还要求别离速度快，别离的组分多。这是一个与色谱热力学和动力学有关的综合性理论问题。它是研制和设计高效、高速、高选择性、顶峰容量色谱柱材料、色谱体系和选择别离操作条件的理论根底。3-1分布平衡(distributionequilibrium)Ka称为吸附平衡常数(adsoptionequilibriumconstant)描述溶质在固定相和流动相中分布的另一个重要参数是分配容量k(partitioncapacity),也称为容量因子capacityfactor)或容量比(capacityratio),定义为溶质在固定相和流动相中分配量(重量、摩尔数)之比，用下式表示：分配容量是描述溶质在两相中分布的简便形式。它将溶质在色谱系统中的分布与其热力学性质联系起来，是选择控制色谱条件的一个最重要的参数.k不仅与固定相、流动相性质及温度有关，还与色谱柱床的结构有关，但与流动相流速及柱长无关。分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，与固定相和温度有关。它与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。2.分配比k分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即

k=组分在固定相中的质量/组分在流动相中的质量=

ms/mmk值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大。它是衡量色谱柱对被别离组分保存能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。k=ms/mm=CsVS/CmVm式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，那么表示固定相的孔体积。分配比k值可直接从色谱图中测得k=(tr–t0)/t0=tr/t0=Vr/V03.分配系数K与分配比k的关系K=k.其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱柱型第三节色谱法根本原理特点的又一个参数。例如，对填充气相柱，其β值一般为5~35；对毛细管气相柱，其β值为50~200。4.分配系数K及分配比k与选择因子α的关系对A、B两组分的选择因子，用下式表示：α=tr(A)/tr(B)=k〔A〕/k〔B〕=K〔A〕/K〔B〕通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，那么α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不第三节色谱法根本原理开。两组分的K或k值相差越大，那么别离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱别离的先决条件。以下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。

溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓浓度沿柱移动距离LABABKA>KB图中KA>KB，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓〔即区域宽度〕也慢慢变宽。显然，区域扩宽对别离是不利的，但又是不可防止的。假设要使A、B组分完全别离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域别离的速度；第三，在保证快速别离的前提下，提供足够长的色谱柱。

第一、二点是完全别离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。3-2、塔板理论

把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。最早由Martin等人1941年提出。由于塔板理论能宏观地解释色谱流出曲线极大点的位置，峰带展宽等现象，以及计算出的塔板数能作为色谱柱效率的较好指标，使用方便，故在色谱上一直沿用这一概念。

塔板理论假设：1.在柱内一小段长度H内，物质可以在两相间迅速到达平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积〔ΔVm〕。3.所有物质开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴〔纵〕向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。为简单起见，设色谱柱由5块塔板〔n＝5，n为柱子的塔板数〕组成，并以r表示塔板编号，r=0，1，2…，n－l；某组分的分配比k=1.根据上述假定，在色谱别离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，假设有单位质量，即m=1〔例1mg或1μg〕的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。〔三〕色谱峰的正态分布〔N>50次〕→近似对称分布讨论：

简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快到达分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：n=L/Hn称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。塔板理论指出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于100时，可得到根本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103~106，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复屡次的分配平衡后，仍可获得良好的别离。第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：n=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2式中tr与W1/2(W)应采用同一单位〔时间或距离〕。从公式可以看出，在tr一定时，如果色谱峰很窄，那么n越大，H越小，柱效越高。第三节色谱法根本原理在实际工作中，由公式n=L/H和n=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的别离效能，因为采用tr计算时，没有扣除死时间t0，所以常用有效塔板数n有效表示柱效：n有效=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2有效板高：H有效=L/n有效因为在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。第三节色谱法根本原理例：某组分峰的峰底宽为40s，保存时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tr/W)2=16〔400/40〕2=1600块

塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效上下的参数。但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。第三节色谱法根本原理3-3、速率理论1956年荷兰学者vanDeemter〔范第姆特〕等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学根底上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为H=A+B/u+Cu式中u为流动相的线速度；A、B、C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。第三节色谱法根本原理1.涡流扩散项A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。

涡流扩散示意图第三节色谱法根本原理由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中迁移路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：A=2λdp上式说明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规那么因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。第三节色谱法根本原理2.分子扩散项B/u〔纵向扩散项〕纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口参加，其浓度分布的构型呈“塞子〞状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为：B=2γDg第三节色谱法根本原理γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dg为组分在流动相中扩散系数〔cm3·s-1〕,分子扩散项与组分在流动相中扩散系数Dg成正比.Dg与流动相及组分性质有关：(a)相对分子质量大的组分Dg小，Dg反比于流动相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子质量较大的流动相，可使B项降低；(b)Dg随柱温增高而增加，但反比于柱压。第三节色谱法根本原理纵向分子扩散使峰展宽〔a〕柱内谱带形状〔b〕相应的响应信号

〔a〕〔b〕第三节色谱法根本原理

另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。第三节色谱法根本原理3.传质阻力项Cu由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。〔1〕气液色谱传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1两项，即C=Cg+C1气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相外表的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的那么进入两相界面又来不及返回气相。这样使得试样第三节色谱法根本原理在两相界面上不能瞬间到达分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为：Cg=0.01k2/(1+k)2dp2/Dg式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体〔如氢气〕做载气，可使Cg减小，提高柱效。液相传质过程是指试样组分从固定相的气/液界面移动到液相内部，到达分配平衡，然后又返回气/液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是造成峰形扩张。第三节色谱法根本原理液相传质阻力系数C1为：C1=2/3k/(1+k)2df2/Dl由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数D1大，那么液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。1-载体；2-固定液液膜；3-毛细深孔和渗入的固定液；4-液固界面；5-气液界面第三节色谱法根本原理将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程：

这一方程对选择色谱别离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。第三节色谱法根本原理影响气相色谱柱柱效的各参数第三节色谱法根本原理(2)液液分配色谱传质阻力系数〔C〕包含流动相传质阻力系数〔Cm〕和固定相传质阻力系数〔Cs〕，即C=Cm+Cs其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即：Cm=mdp2/Dm+smdp2/Dm第三节色谱法根本原理

式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀的。这种传质阻力对板高的影响与固定相粒度dp的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数Dm成反比，ωm是由柱和填充的性质决定的因子。

第三节色谱法根本原理移动流动相的传质阻力引起的色谱峰形的扩展1-进样后的起始峰形；2-移动流动相在固定相颗粒间构成的层流；3-固定相基体；4-样品移出色谱柱时的峰形第三节色谱法根本原理右边第二项为滞留的流动相中的传质阻力。这是由于固定相的多孔性，会造成某局部流动相滞留在一个局部，滞留在固定相微孔内的流动相一般是停滞不动的。如果固定相的微孔既小又深，传质速率就慢，对峰的扩展影响就大。式中ωsm是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据局部的分数及容量因子有关。显然，固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，传质速率就愈快，柱效就高。对高效液相色谱固定相的设计就是基于这一考虑。第三节色谱法根本原理滞留流动相的传质阻力引起的色谱峰形的扩展1-进样后的起始峰形；2-滞留流动相；3-固定液膜4-固定相基体；5-样品移出色谱柱时的峰形第三节色谱法根本原理液液色谱中固定相传质阻力系数〔Cs〕可用下式表示：Cs=sdf2/Ds公式说明试样分子从流动相进入固定液内进行质量交换的传质过程与液膜厚度df的平方成正比，与试样分子在固定液的扩散系数Ds成反比。式中ωs是与容量因子k有关的系数。

第三节色谱法根本原理综上所述，对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为：气相色谱速率方程和液相色谱速率方程的形式根本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。第三节色谱法根本原理4.流动相线速度对板高的影响〔1〕 LC和GC的H-u图根据vanDeemter公式作LC和GC的H-u图，LC和GC的H-u图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多；LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。第三节色谱法根本原理第三节色谱法根本原理对范氏方程微分:所以:

第三节色谱法根本原理(2)分子扩散项和传质阻力项对板高的奉献较低线速时，分子扩散项起主要作用；较高线速时，传质阻力项起主要作用，其中流动相传质阻力项对板高的奉献几乎是一个定值。在高线速度时，固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素，随着速度增高，板高值越来越大，柱效急剧下降。第三节色谱法根本原理5.固定相粒度大小对板高的影响第三节色谱法根本原理粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。第四节别离度柱效和选择性对别离的影响。图中〔a〕两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中〔b〕虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。图中〔c〕别离最理想，说明选择性好，柱效也高。第四节别离度别离度R是一个综合性指标。别离度是既能反映柱效率又能反映选择性的综合指标，称总别离效能指标。别离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保存值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即R=2(tr2-tr1)/〔W1+W2〕R值越大，说明相邻两组分别离越好。一般说，当R<1时，两峰有局部重叠；当R=1时，别离程度可达9