8章吸光光度法课件

化学分析：常量组分(>1%),Er:0.1%～0.2%

依据化学反应,使用玻璃仪器

化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(<1%),Er:1%～5%

依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例:

含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)≈0.1mg容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法结果0.048%～0.052%,满足要求准确度高灵敏度高2023/7/202.电化学分析法:

依据物质的电化学性质及其变化3.色谱法:

气相色谱,液相色谱4.质谱法、热分析法、放射化学法等非光谱法（折射法，浊度法，旋光法）（不以光的波长为特征讯号）光谱法分子光谱法

UV/Vis,IR原子光谱法

AAS,AES（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）光学分析法1.光学分析法:基于电磁辐射与物质的相互作用.2023/7/20吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法基于外层电子跃迁吸收光谱发射光谱散射光谱分子光谱原子光谱2023/7/208.1

概述

一.特点

灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1,(10-8mol·L-1)准确度高:能够满足微量组分的测定要求：相对误差2～5％（1～2％）操作简便快速应用广泛2023/7/20

包括：比色法、可见分光光度法、紫外分光光度法、红外光谱法等。

2023/7/20结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.二、光的基本性质光是一种电磁波，它具有波粒二象性，光具有一定的能量。E=hν=hc/λ2023/7/201

吸收光谱产生的原因光:一种电磁波,波粒二象性

光谱名称波长范围X射线0.1~10nm远紫外光10~200nm近紫外光200~400nm可见光400~750nm近红外光0.75~2.5um中红外光2.5~5.0um远红外光5.0~1000um微波0.1~100cm无线电波1～1000m当光子的能量与分子的E匹配时，就会吸收光子

E=hu=hc/l2023/7/20光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~400nm400nm

~780nm780nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m2023/7/20三、物质对光的选择性吸收单色光：具有相同能量(相同波长)的光.复合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光.互补光：把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合，成为白光，称为互补色光。

2023/7/20/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-780红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光2023/7/20物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光2023/7/20吸收曲线：测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，得到的一条吸收光谱曲线。用途：①进行定性分析；②进行定量分析；③选择吸收波长；④判断干扰情况。2023/7/20吸收曲线的讨论：（1）不同物质,曲线形状不同，最大吸收波长λmax不同，可用作定性鉴定各种物质（2）同一种物质，浓度不同，其吸收曲线形状相似，λmax不变。2023/7/20（3）同一种物质，浓度不同，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。（4）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。2023/7/20苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯(254nm)甲苯(262nm)A2302502702023/7/208-2光的吸收定律

──朗伯-比耳（Larnbert-Beer）定律吸光度与物质浓度

A∝c吸光度与液层厚度

A∝b①②2023/7/20朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

当入射光的

,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比尔定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

当入射光的,液层厚度b

一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.2023/7/20一.朗伯-比尔定律意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=kbc2023/7/20透光率(透射比）T（Transmittance）A=—lgT=lg(1/T)=lg(I0/It)=Kbc吸光度A

(Absorbance）I0It入射光透过光2023/7/20吸光度A、透射比T与浓度c的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

202023/7/20K的表示方法a

的单位:L·g-1·cm-1当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，a

－吸光系数Absorptivity

A＝abcε

的单位:L·mol-1·cm-1当c的单位用mol·L-1表示时，用ε表示.

－摩尔吸光系数MolarAbsorptivity

A＝ε

bc

ε

=Ma

2023/7/20摩尔吸光系数e灵敏度表示方法A=e

bcA=Kbcc:mol/Le

表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位：

(L•mol-1•cm-1)c:g/LA=abca:吸光系数2023/7/20

ε可作为物质的吸光能力的度量

ε越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε

>105：超高灵敏；

ε

=(6～10）×104：高灵敏；

ε

=104～103：中等灵敏；

ε

<103：不灵敏。2023/7/20朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光

应选用max处或肩峰处测定.3.稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强.2.吸光质点形式不变

离解、配合、缔合会破坏线性关系,

应控制条件(酸度、浓度、介质等).2023/7/20溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx2023/7/20例题铁（Ⅱ）浓度为5.0×10-4

g·L-1

的溶液，与1，10-邻二氮菲反应，生成橙红色络合物。该配合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.19。计算1，10-邻二氮菲铁的a及ε。需要知两个公式A=abc以及ε=Ma,解：先求a，再求ε已知MFe=55.85a=A/bc=0.19/2×5.0×10-4=190L·g-1·cm-1ε=Ma=55.85×190=1.1×104L·mol-1·cm-12023/7/20吸光度的加和性与吸光度的测量

A=A1+A2+…+An

用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。2023/7/20吸光度的加和性A1=e1bc1A2=e2bc2A

=e1bc1+e2bc2

根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和

A=A1+A2+…+An2023/7/20二.偏离比尔定律的原因2023/7/201.非单色光引起的对吸光定律的偏离λ1λ22023/7/20实际上入射光为：λ1+λ2当κ1=

κ2时，A总

=

κ1bc，遵守比耳定律当κ1≠

κ2时，A总

≠

κ1bc，偏离比耳定律2023/7/20吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离质点间的静电作用质点的散射质点间的化学反应2023/7/20

溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡破坏了平衡浓度分析浓度的正比关系，造成对朗伯—比耳定律的偏离。

2.散射

试样不均匀,被测液含悬浮物或胶粒等散射指点时,入射光因散射而损失。3.化学因素例：Cr2O72-+

H2O=

CrO42-+

2H+橙色（λmax=350nm）黄色（λmax=375nm）2023/7/20

朗伯—比耳定律是建立在所有的吸光质点之间不发生相互作用的前提下的，当溶液浓度较高（c>10-2

mol·L-1）时，吸光质点间分子或离子的平均距离减小，就会发生相互作用而改变吸光质点的电荷分布，改变它们对光的吸收能力，即改变吸光质点的摩尔吸光系数，浓度越大，这种影响就越显著。朗伯—比耳定律只适用于稀溶液(c<10-2mol·L-1)。

4.溶液浓度2023/7/208.2光度计及基本部件方便、灵敏，准确度差.常用于限界分析.1.目视比色法观察方向空白c1c2c3c42023/7/20目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高2023/7/202.光电比色法光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)滤光片的颜色与有色溶液的颜色互补.2023/7/203.吸光光度法和分光光度计光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.2023/7/20常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185~375紫外氘灯185~400紫外钨灯320~2500可见，近红外卤钨灯250~2000紫外，可见，近红外氙灯180~1000紫外、可见（荧光）能斯特灯1000~3500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段2023/7/20单色器作用:产生单色光常用的单色器：棱镜和光栅样品池（比色皿）

厚度(光程):0.5,1,2,3,5…cm

材质：玻璃比色皿－－可见光区石英比色皿－－可见、紫外光区2023/7/20吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。

可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池检流计（指示器）：

低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。

光电池，光电管，光电倍增管2023/7/20检测器

作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号常用检测器：光电管光电倍增管光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长2023/7/20单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。

棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同.玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ28006005004002023/7/20光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.－平面透射光栅－反射光栅（广泛使用）光栅衍射示意图M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅2023/7/20硒光电池（Barrier-layerphotocell）适用于300-800nm,在500-600nm范围最灵敏。Se阴极Au，Ag半导体h阳极2023/7/20光电管(Phototube)h（片）红敏管625-1000nm蓝敏管200-625nm2023/7/20光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1个光子可产生106～107个电子160-700nm2023/7/20目视比色法—比色管光电比色法—光电比色计

光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计分光光度法与分光光度计

722型分光光度计光学系统图1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅9.比色池；10.光电管2023/7/203、光度计组成：2023/7/202023/7/20练习题1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范围是A.400-780nmB.200-320nmC.200-780nmD.200-1000nm答案：A2、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大时，最大吸收波长和吸光度分别是A.不变，增加B.不变，减少C.增加，不变D.减少，不变答案：A

2023/7/203、下列表述不正确的是A.吸收光谱曲线，表明了吸光度随波长的变化关系B.吸收光谱曲线中,最大吸收处的波长为最大吸收波长C.吸收光谱曲线，以波长为纵坐标,以吸光度为横坐标D.吸收光谱曲线，表明了吸光物质的吸收特性答案：C4、影响有色物质摩尔吸收系数的因素是A.吸收池厚度B.入射光波长C.有色物质溶液的浓度D.入射光的强度答案：B2023/7/205、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度为c时，用1.00cm比色皿测得其透光度为T，，当浓度减小为0.50c时，，在同样条件下测定，其透光率应为

A.T2B.2TC.T1/2D.T/2答案：c

lg1/T=εbc

6、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度为c时，吸光度A=0.30，那么当浓度为2c时，该溶液的吸光度A

=。0.602023/7/208-4

显色反应及显色条件的选择一.显色剂与显色反应无机显色剂:SCN-

[Fe(SCN)]2+

H2O2

[TiO·H2O2]2+硫氰酸盐：测定Fe3+、Mo(Ⅵ)、W(Ⅴ)钼酸铵：测定P、Si、W等。过氧化氢：测定V5+、Ti4+等2023/7/20：：：：助色团－NH2，－OH，－X（孤对电子）O生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）有机显色剂:①偶氮类：偶氮胂Ⅲ，偶氮氯膦，PAR等；②三苯甲烷类：铬天青S，二甲酚橙，结晶③其它型：OO,NN,含S型等。2023/7/20有机显色剂CH3－C－C－CH3HO－NN－OH

＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸2023/7/20二.显色反应的选择

灵敏度高，一般ε

>104;选择性好;对比度大,△max=MRmax

-Rmax>60nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好.2023/7/20三.显色条件的确定c(R)c(R)c(R)1.显色剂用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+

浅红Mo(SCN)5

橙红Mo(SCN)6-浅红Fe(SCN)n3-n2023/7/202.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）pH1<pH<pH2pH2023/7/2025℃50℃t/minA3.显色温度及显色时间

(c(M)、c(R)、pH一定)另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等.2023/7/204.显色温度的选择：一般在室温，有时需加热，通过实验确定2023/7/205.干扰及其消除：（1）控制溶液酸度；（2）加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂；（3）选择适当的波长，要求吸收大，干扰小；（4）选择合适的参比溶液；（5）采用适当的预先分离的方法。2023/7/20Fe3+,Cu2+FeSSal（紫红）Cu2+pH=2.5SSal测Fe3＋:(控制pH)如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。（1）控制溶液酸度；2023/7/20（2）加入配位掩蔽剂Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋

:2023/7/20（3）选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III

钴-亚硝基红盐

AA络合物络合物试剂试剂/nm/nm2023/7/20四、多元配合物多元配合物是由三种或三种以上的组分所形成的配合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元配合物，三元配合物在吸光光度分析中应用较普遍。主要特点为；1、稳定性强；2、对比度和灵敏度高；3、选择性好。2023/7/209-5吸光度测量条件的选择一、入射光波长的选择1、原则：“吸收最大，干扰最小”，2023/7/20二、参比溶液的选择1、蒸馏水：试液、显色剂均无色时，用蒸馏水作参比；2、试剂空白：显色剂有色时，用不加试样溶液的试剂空白作参比；3、试液空白：试液中有其它有色离子时，用不加显色剂的被测液作参比；4、褪色空白：显色剂和试液均有色时，加一掩蔽剂掩蔽被测组分，以此溶液作参比；2023/7/20三、吸光度读数范围的选择A=-lgT=εbc,(1)-d（lgT）=-0.434d（lnT）=εbdc=-0.434dT/T=εbdc(2)=同除εbc,以有限值表示：=ΔT：±0.2%~±2%。假定为0.5%，2023/7/202023/7/201086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,)2023/7/20四、标准曲线的制作1、制作依据：比尔定律A=εbcA∝c

2、制作方法：在选择的实验条件下，从低浓度到高浓度分别测量一系列（不少于5）不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（或工作曲线）。此时再测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。3、标准曲线不通过原点原因：参比选择不当；吸收池厚度不等；吸收池位置不妥；吸收池不清洁等。2023/7/20练习题1、以M表示被测物质的摩尔质量，则摩尔吸收系数ε与吸光系数a之间的关系为A.ε=a/MB.ε=aMC.ε=aM/1000D.ε=(a/M)×1000答案：

B2、在光度分析中，选择参比溶液的原则是A.一般选蒸馏水B.一般选试剂溶液C.根据加入试剂和被测试液的颜色性质选择D.一般选褪色溶液答案：C2023/7/203.下列几组吸光度范围，测量相对误差较小的A.0.2~0.8B.0.1~0.8C.0.3~0.6D.0.2~0.6答案：C4、下列表述中错误的是A.吸收峰随浓度增加而增高，但最大吸收波长不变B.透射光与吸收光互为补色光，黄色和兰色互补C.比色法又称分光光度法D.在公式A=εbc中，ε称摩尔吸收系数，其数值越大，反应越灵敏答案：C2023/7/205、某有色物质溶液的吸光度值较小时，则表明A.该物质的浓度较小B.该物质摩尔吸收系数较小C.所用比色皿较薄D.上述三者都可能答案：D6、一有色溶液在一定波长下，测定其吸光度为0.740，如果溶液及比色皿都减小一半，则其吸光度为A.2.96

B.0.740

C.0.370D.0.185答案：D2023/7/207、为使某待测物质测定的灵敏度较高，则应选择A.较高浓度的待测溶液B.采用具有较大吸收系数的体系C.在较长的波长下进行D.用较强的光源答案：B2023/7/208.5吸光光度法的应用一.单一组分的测定1.金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂2.磷的测定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,

可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(小)磷钼(V)蓝(大)Sn2+2023/7/20二.多组分的测定εxl1,εyl1,εxl2,εyl2由x,y标液在1,2处分别测得.(1)在1处测组分x,在2处测组分y.(2)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y.(3)x,y组分不能直接测定A1=εxl1bcx+εyl1bcy(在1处测得A1)

A2=εxl2bcx+εyl2bcy(在2处测得A2)2023/7/20

三.光度滴定NaOH滴定对硝基酚pKa=7.15