微生物发酵机制培训课件

微生物发酵机制发酵的类型

根据微生物的种类不同，可分为好氧性发酵、厌氧性发酵和兼性发酵。（1）好氧性发酵：在发酵过程中需要通入一定量的无菌空气，满足微生物呼吸需要。

2微生物发酵机制（2）厌氧性发酵：在发酵过程中不需要供给无菌空气。

（3）兼性发酵：在有氧、无氧条件下均能生活。如酿酒酵母，在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧发酵，大量繁殖菌体细胞。3微生物发酵机制发酵机制：微生物通过其代谢活动，利用基质（底物）合成人们所需要的代谢产物的内在规律积累的产物微生物菌体酶代谢产物厌气发酵：酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇等好气发酵：有机酸、氨基酸、蛋白质、核苷酸、抗生素、维生素等4微生物发酵机制代谢控制发酵：人为的改变微生物的代谢调控机制，使有用的代谢产物过量的积累。发酵机制研究的内容：1.微生物的生理代谢规律（就是各种代谢产物合成途径及代谢调节机制）；2.环境因素（营养条件、培养条件等）对代谢的影响及改变代谢的措施；5微生物发酵机制糖酵解途径及调节机制

葡萄糖经EMP途径：C6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD2CH3COCOOH+2ATP+2NADH26微生物发酵机制EMP糖酵解途径7微生物发酵机制糖酵解途径及特点EMP途径大致可分为三个阶段1，6-二磷酸果糖的生成，消耗2分子ATP；1，6-二磷酸果糖降解为3-磷酸甘油醛；3-磷酸甘油醛经五步反应转化为丙酮酸，产生4分子ATP它是动物、植物、微生物细胞中G分解产生能量的共同途径。EMP的每一步都是由酶催化的。己糖激酶；磷酸果糖激酶（该酶受ATP、柠檬酸的抑制，为AMP所激活）；丙酮酸激酶；3-磷酸甘油醛脱氢酶（受碘乙酸抑制）；烯醇化酶（受氟化物抑制）。8微生物发酵机制

当以其他糖类作为碳源和能源时，先通过少数几步反应转化为糖酵解途径的中间产物，然后沿着糖酵解途径进行降解。丙酮酸的不同去路。反应中生成的NADH2不能积存，必须被重新氧化为NAD后，才能继续不断地推动全部反应，在不同的机体，在不同的环境下（如氧气的有无），氢的受体不同，丙酮酸的去路也不同。9微生物发酵机制

在无氧条件下：

在乳酸菌中受乳酸脱氢酶的作用，丙酮酸作为受氢体而被还原为乳酸，即同型乳酸发酵；

在酵母菌中，丙酮酸受丙酮酸脱羧酶的作用生成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的作用下作为受氢体被还原为乙醇，即酒精发酵；

在梭状芽孢杆菌中，丙酮酸脱羧生成乙酰COA，然后经一系列变化生成丁酰COA、丁醛，两者作为受氢体被还原生成丁醇，生成物中还有丙酮、乙醇，所以称为丙酮-丁醇发酵。10微生物发酵机制乙醇乳酸11微生物发酵机制在好氧发酵条件丙酮酸进入TCA环，进行代谢，产生各种好氧代谢产物或完全氧化获得能量。12微生物发酵机制B、

三羧酸循环三羧酸循环一定需要氧才能进行。在三羧酸循环中脱下的氢，形成NADH和FADH2，然后再逐步传递给氧。13微生物发酵机制丙酮酸三个二氧化碳三羧酸循环14微生物发酵机制A.厌氧发酵机制15微生物发酵机制第一节酒精发酵机制1酵母菌的酒精发酵

16微生物发酵机制

1.1酒精生成机制(1)葡萄糖（glucose）EMP丙酮酸（pyruvicacid）己糖磷酸化作用EMP六碳糖转变为三碳糖磷酸丙糖丙酮酸(2)丙酮酸乙醇丙酮酸丙酮酸脱羧酶乙醛（acetaldehyde）乙醛乙醇脱氢酶乙醇（alcohol）

由葡萄糖生成乙醇的总反应式为

C6H12O6+2ADP+2H3PO42CH3CH2OH+2CO2+2ATP17微生物发酵机制酵母菌在无氧的条件下，通过以上12步反应，1分子G生成２分子的乙醇，２分子的CO2和2分子ATP。则1mol葡萄糖生成2mol乙醇，理论转化率为2×46.05/180.1×100%=51.1%但是在生产中大约有5%的葡萄糖用于合成酵母细胞和副产物，实际上乙醇生成量约为理论值的95%，则乙醇对糖的实际转化率约为48.5%。

18微生物发酵机制巴斯德效应巴斯德效应:好气条件下，酵母菌发酵能力下降（细胞内糖代谢降低，乙醇积累减少）；好气条件下，代谢进入TCA环→柠檬酸↑、ATP↑→抑制激酶→6-P-葡萄糖↑→反馈抑制己糖激酶→抑制葡萄糖进入细胞内→葡萄糖利用降低。

19微生物发酵机制同时，好气条件下，丙酮酸激酶活性降低。丙酮酸激酶活性降低也是由于磷酸果糖激酶活性降低所致。丙酮酸激酶活性↓→使磷酸烯醇式丙酮酸↑→反馈抑制己糖激酶活性→糖酵解速度↓20微生物发酵机制

1.2酒精发酵中副产物的形成

主产物（product）：乙醇（alcohol）副产物（byproduct）：40多种二氧化碳（carbondioxide）甘油（glycerol）乙醛（acetaldehyde）琥珀酸（succinicacid）乙酸（aceticacid）酯（ester）高级醇（higheralcohol）双乙酰（diacetyl）21微生物发酵机制1.2.1杂醇油的生成杂醇油是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称，主要由正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇组成，这些高级醇是构成酒类风味的重要组成成分之一，当其过量时会影响产品质量，是酒类产品中质量指标之一，应予以控制。1.2.1.1酒精发酵中高级醇的形成途径a.氨基酸氧化脱氨作用b．由葡萄糖直接生成22微生物发酵机制酒精发酵中高级醇形成的途径（1）氨基酸氧化脱氨作用缬氨酸异丁醇异亮氨酸活性戊醛酪氨酸酪醇苯丙氨酸苯乙醇

亮氨酸＋ɑ－酮戊二酸ɑ－酮异己酸转氨酶+谷氨酸异戊醇异戊酸醇脱氢酶23微生物发酵机制（2）由葡萄糖直接生成ɑ－酮酸（碳原子低的）活性乙醛ɑ－酮酸（碳原子高的）还原、异构、脱水醇＋缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸醇24微生物发酵机制1.2.1.2影响杂醇油形成的条件a.菌种:在同样的条件下，不同菌种的杂醇油生成量相差很大。酵母的杂醇油生成量与醇脱氢酶活性关系密切，该酶活力高，杂醇油生成量大。b.培养基组成:培养基中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）的存在，可增加相应的高级醇（异戊醇、活性戊醇和异丁醇）的生成量。培养基中氮水平高，形成杂醇油量少，杂醇油总形成量因氮水平高而降低。c.发酵条件:一般发酵温度高，高级醇生成量高，通风有利于高级醇生成。高级醇的生成与乙醇的生成是平行的，随乙醇的生成而生成。25微生物发酵机制1.2.2双乙酰（diacetyl）1.2.2.1双乙酰合成途径双乙酰是啤酒生产过程中的重要成分，它是酵母细胞内生物合成缬氨酸、亮氨酸的中间产物；也是衡量啤酒成熟和质量水平的主要指标。它赋予啤酒一种不愉快的馊味，淡色贮藏啤哂的双乙酰含量应控制在0.1mg/L以下。双乙酰是α-乙酰乳酸在酵母细胞外非酶氧化的产物，是酵母在生长繁殖时，在酵母细胞体内用可发酵性糖经α-乙酰乳酸合成它所需的缬氨酸、亮氨酸途径中的副产物，中间产物α-乙酰乳酸部分排出酵母细胞体外，经氧化脱羧作用生成双乙酰。26微生物发酵机制CH3CHO-TPP(活性乙醛)CH3COCOOH-乙酰乳酸缬氨酸双乙酰2,3-丁二醇非酶氧化酵母还原+双乙酰合成消除途径27微生物发酵机制1.2.2.2双乙酰的消除措施:１.提高麦汁中氨基氮的含量；提高麦汁中缬氮酸的含量通过反馈作用，抑制从丙酮酸合成缬氨酸的支路代谢作用。２.利用酵母的还原作用，将双乙酰转变成2,3-丁二醇；３.利用二氧化碳的洗涤作用，排除双乙酰。4.加入-乙酰乳酸脱羧酶;5.使用基因工程构建的含有-乙酰乳酸脱羧酶的酵母菌株28微生物发酵机制

酯是啤酒香味的主要组成成分，它是通过酯酰辅酶A与醇缩合而形成的。传统淡色啤酒以酒花香为主体香，含有适量的酯，才使啤酒香味丰满协调。过高的酯含量会使啤洒有不愉快的香味。近代啤酒中的酯含量与高级醇一样，普遍有升高的趋势。有的酒其乙酸乙酯大于阈值，有淡雅的果实香味，也成为一种独特的风味。1.3酯类物质29微生物发酵机制啤酒的香味果酒的香味酒花香麦芽香发酵过程形成的各种酯类的香味果香发酵香陈酿香形成途径：通式：R-CO-SCOA+ROHRCOOR+COA-SHR-CO-SCOA脂肪酸的激活作用酮酸的氧化作用30微生物发酵机制在ATP的作用下，使脂肪酸活化酮酸的氧化作用R-COOH+ATP+COA-SHRCO－SCOA+AMP+PPi

RCOCOOH+NAD+COASHRCO-SCOA+NADH2+CO2

影响酯含量因素:a.酵母菌种，不同的酵母菌种，发酵时形成的酯量是不同的；b.发酵温度高，有利于酯类的形成；c.接种量大，酯类的形成量低。31微生物发酵机制2.细菌的酒精发酵（alcoholicfermentationofbacteria)

菌种为运动发酵单孢菌（ZymomonasMobilis），少数假单胞杆菌（Pseudomonas），如林氏假单胞菌（Ps.lindneri）能利用G经ED途径进行酒精发酵。总反应式为

C6H12O6+ADP+H3PO4→2C2H5OH+2CO2+ATP

产物和酵母菌的酒精发酵相同，但产能水平各异。

32微生物发酵机制ED途径(脱氧酮糖酸途径)由部分EMP途径、部分HMP途径组成

ED途径的

三个阶段

1、G氧化分解6--磷酸葡萄糖酸+NADP·H（HMP）

2、6--磷酸葡萄糖酸三碳糖

6---P--葡萄糖酸脱水酶

6---P--葡萄糖酸2--酮--3--脱氧--6--P--葡萄糖酸2--酮--3--脱氧--6--P--葡萄糖酸丙酮酸+3--P--甘油醛3、氧化产能阶段

3--P--甘油醛EMP丙酮酸

总反应式C6H12O6+NADP++NAD++ADP+Pi2CH3COCOOH+NAD·2H++NADP·2H+ATP

33微生物发酵机制

细菌酒精发酵的特点代谢速度快；发酵周期短，比酵母菌的酒精产率高；厌氧且耐高温；能利用多种糖类发酵工艺技术要求高优点：缺点：34微生物发酵机制第二节乳酸发酵机制一、同型乳酸发酵：

进行乳酸发酵的主要是细菌。它们利用糖经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸还原产生乳酸。发酵产物中主要为乳酸的称为同型乳酸发酵。如乳链球菌（Streptococcuslactics）、乳酪链球菌（Streptococcuscremoris）、干酪乳杆菌（lactobacilluscasei）、保加利亚乳杆菌（Lac.bulgaricus）等。35微生物发酵机制

2H（乳酸脱氢酶）C6H12O6

EMP

2CH3COCOOH

2CH3CHOHCOOH

同型乳酸发酵的特点：

1mol的G产生2mol乳酸，理论转化率是100%。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。36微生物发酵机制二、异型乳酸发酵

发酵产物中除乳酸外同时还有比例较高的乙酸、乙醇、二氧化碳等，称为异型乳酸发酵。其生物合成途径有两种。

1.6-磷酸葡萄糖酸途径：葡萄糖经6-磷酸葡萄糖生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成5-磷酸木酮糖；后者经磷酸解酮酶催化，分解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶作用变为乙酰CoA，再经乙醛脱氢酶作用生成乙醇。而3-磷酸甘油醛经EMP途径生成丙酮酸。后者经乳酸脱氢酶催化还原为乳酸。

37微生物发酵机制葡萄糖ATPADP6－磷酸葡萄糖1NADNADH＋H＋6－磷酸葡萄糖酸2NADNADH＋H＋5－磷酸核酮糖35－磷酸木酮糖乙酰磷酸乙酰乙酰CoANADH＋H＋NAD乙醛NADH＋H＋NAD乙醇3－磷酸甘油醛乳酸ADPATPNADNADH＋H＋NADNADH＋H＋485766－磷酸葡萄糖酸生成乳酸和乙醇己糖激酶6－磷酸葡萄糖脱氢酶6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶4.5－磷酸核酮糖－3－差向异构酶5.磷酸解酮酶6.磷酸转乙酰酶7.乙醛脱氢酶8.醇脱氢酶38微生物发酵机制

通过该途径，1mol的G产生1mol的乳酸，乳酸对糖的理论转化率是50%。另外有比例较高的乙醇、乙酸和二氧化碳等。

肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）及葡聚糖明串珠菌（Leuconostocdextranicum）通过该途径进行异型乳酸发酵。39微生物发酵机制2.Bifidus途径（双歧途径）：双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum)进行的乳酸发酵也是一条磷酸解酮酶途径。该途径的特点是：①有两个磷酸解酮酶参与；

②在没有氧化作用和脱氢作用下，2分子G分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸甘油醛。接着，在3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的参与下，3-磷酸甘油醛转化为乳酸，转化率为50%。40微生物发酵机制葡萄糖ATPADP6－磷酸果糖6－磷酸果糖ADPPi4－磷酸赤藓糖3－磷酸甘油醛7－磷酸景天庚酮糖5－磷酸木酮糖5－磷酸核糖乙酰磷酸ATP乙酰5－磷酸木酮糖5－磷酸核酮糖乙酰磷酸2分子3－磷酸甘油醛乳酸ADPATPNAD＋NADH＋H＋NAD＋NADH＋H＋ADPATP3分子乙酸葡萄糖经双歧途径发酵生成乳酸和乙酸13245676-磷酸果糖解酮酶转二羟基丙酮基酶转羟乙醛基酶5－磷酸核糖异构酶5－磷酸核酮糖－3－差向异构酶5－磷酸木酮糖磷酸酮解酶乙酸激酶

41微生物发酵机制第三节甘油发酵机制一、亚硫酸盐法甘油发酵酵母菌在酒精发酵时，如加入亚硫酸氢钠等盐类，它能与乙醛起加成作用，生成难溶的结晶状亚硫酸钠加成物，这样就使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮作为受氢体，在α-磷酸甘油脱氢酶（NAD为辅酶）催化下生成α-磷酸甘油，后者在α-磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成α-甘油。CH2OHOHC6H12O6+NaHSO3→CHOH+CH3-

C-HOSO2Na+CO2

CH2OH

42微生物发酵机制2ATP2ADP2ADP2ATPCO2NaHSO3NAD﹢NADH+H﹢NADH+H＋NAD﹢H2OPi酵母菌酒精发酵Ⅱ型葡萄糖1.6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮丙酮酸乙醛乙醛HSO3α-磷酸甘油甘油43微生物发酵机制

1mol葡萄糖只产生1mol甘油，不产生ATP，整个过程无ATP积余，可见在甘油发酵过程中亚硫酸盐不能加得太多，否则会使酵母菌因得不到能量而终止发酵，必须留一部分酒精发酵，以使获得一些能量，供生命活动所需。该过程也称酵母菌的II型发酵。

44微生物发酵机制二碱法甘油发酵

酒精酵母的发酵液在保持碱性（pH7.6以上）的条件下，乙醛不能作为正常的受氢体，乙醛在碱性溶液里２分子乙醛之间发生歧化反应，相互氧化还原，生成等量的乙醇和乙酸。此时，由３－磷酸甘油醛脱氢生成的NADH+H+用来还原磷酸二羟丙酮，并进而生成甘油．CH2OH2C6H12O6+H2O2CHOH+C2H5O

H+CH3COOH+2CO2

CH2OH

碱法甘油发酵的产品有甘油、乙醇、乙酸，也不产生ATP，所以此法只能在酵母的非生长情况下进行发酵。该过程也称酵母菌的Ⅲ型发酵。45微生物发酵机制

第四节沼气发酵机制沼气（biogas）(甲烷，methane)

甲烷发酵属于厌氧消化(anaerobicdigestion)处理，是有机物厌氧分解过程中的主要过程。利用厌氧菌将工厂废水、下水污泥中所含有的有机物进行分解，不用对培养基进行灭菌和纯种培养和接种操作。它可以作为好氧处理的前阶段处理。甲烷气体（沼气）是生物燃气的主要成员。

46微生物发酵机制

一、甲烷发酵机理

甲烷发酵是厌氧菌将碳水化合物、脂肪、蛋白质等复杂的有机物最终分解成甲烷和CO2，甲烷发酵不是由单一的甲烷产生菌所能完成的，甲烷发酵至少由三个阶段组成：

第一个阶段是有机聚合物水解生成单体化合物，进而分解成各种脂肪酸、CO2和H2；第二阶段是各类脂肪酸进行分解，生成乙酸、CO2和H2；第三个阶段是由乙酸和CO2及H2反应生成甲烷；

47微生物发酵机制前两个阶段也可统称为产酸阶段，产酸阶段也叫液化阶段，参与这一阶段反应的微生物大部分是兼性厌氧细菌，只有少数的原生动物、霉菌和酵母参与这一反应。发酵液中这一类非甲烷产生菌的数量大体上与甲烷产生菌相等。第三个阶段的产气称为甲烷发酵，参与这一过程的细菌总称为甲烷菌。

48微生物发酵机制

复杂有机物

←发酵细菌

可溶性简单有机物

←产酸菌

挥发性脂肪酸（丙酸，异丁酸，异戊酸）专性质子还原菌醋酸H2+HCO3纯醋酸菌CH4

甲烷菌CH4

HCO3H+HCO3H2CO3H2O+CO2H2O49微生物发酵机制

二、甲烷发酵的微生物

产酸阶段也叫液化阶段，参与的微生物大部分是兼性厌氧菌，只有少量的原生动物、霉菌和酵母参与这一反应。产酸阶段的细菌有：梭菌属（Clostridium）；芽孢杆菌（Bacillus）；葡萄球菌属（Staphlococccus）；变形杆菌属（Froteis）；杆菌属(Bacterium)。

50微生物发酵机制甲烷产生阶段主要是甲烷产生菌参与。产甲烷菌是严格厌氧菌，不产孢子。采用新的厌气培养技术，可以分离得到20种以上的甲烷产生菌，如：甲烷杆菌属（Methanobacterium）；甲烷短杆菌属（Methanobrevibacterium）；产甲烷菌属（Methanococci）；甲烷微球菌属（Methanomicrobium）等细菌。51微生物发酵机制

各种甲烷菌之间在RNA排列顺序上都很相似，它们都是具有嗜盐性，而且比典型的细菌耐温和耐酸。所以有人将甲烷菌和嗜盐菌、嗜热菌、嗜酸菌等一起分类属于古细菌。甲烷菌和非甲烷菌叫沼气菌（biogasproducingbacteria）。发酵液中非甲烷产生菌的数量与甲烷产生菌相等，达106~108个/ml。甲烷发酵的三个阶段是相互依赖和连续进行的，并保持动态平衡。如果平衡遭到破坏，沼气发酵就受到影响，甚至停止。52微生物发酵机制三、甲烷发酵的各种条件

1)菌种培养：取自然界正在进行甲烷发酵的河沟或沼泽底部的污泥或工厂废水加入甲烷发酵槽，保持适当温度，使细菌繁殖；2)发酵温度：中温发酵37C~38C；高温发酵53C~54C；在一种温度下长期持续培养，在另一种温度下就很难获得满意的效果，这是因为两类甲烷菌种类不同造成的。高温发酵处理能力较低温发酵大2.5倍。53微生物发酵机制3)废水组成：废水中要有营养，除作为能源的碳源外，还有氮源。废水中的磷不足，可用化肥补充，甲烷发酵的最适pＨ值为7，不适时，可进行中和；4)污泥浓度：甲烷发酵中，持续进行的厌氧污泥将在液体中积累，含有甲烷细菌体、碳酸盐、氢氧化钠、硫化物、未分解的污泥残渣，污泥越多，越能促进甲烷发酵；5)抑制物：有硫化物、硝酸盐、许多重金属、洗涤剂和醇类特别是不饱和醇，首先抑制甲烷菌，使气体减少，抑制物浓度再高，产酸菌也受到抑制。54微生物发酵机制B.好氧发酵机制55微生物发酵机制

好氧性发酵(aerobicfermentation)：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、利用黄单孢菌进行黄原胶－多糖的发酵等等．糖的分解代谢包括糖酵解（糖的共同分解途径）和三羧酸环（糖的最后氧化途径）。56微生物发酵机制第一节柠檬酸的发酵机制一、柠檬酸的合成途径

黑曲霉(Asp.niger)原料：糖类，乙醇，醋酸途径：EMP（HMP）丙酮酸羧化TCA环黑曲霉生长，EMP与HMP途径的比率是2：1，生产柠檬酸时为4：1。葡萄糖柠檬酸(citricacid)理论转化率：106.7%57微生物发酵机制柠檬酸的发酵机制柠檬酸在食品中的应用柠檬酸发酵微生物柠檬酸发酵机理58微生物发酵机制1)

饮料与冰淇淋柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。59微生物发酵机制2)

果酱与酿造酒柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。60微生物发酵机制3)

腌制品

各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。61微生物发酵机制4)

罐头食品

加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。62微生物发酵机制5)

豆制品及调味品用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等）的调味。63微生物发酵机制6)

其它柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。64微生物发酵机制柠檬酸的消费领域：饮料行业占40～45％食品添加剂等占15～20％洗涤剂占20～30％医药占5％其它占10％2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。65微生物发酵机制柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产，产量最大的有机酸。我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约50万吨欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约30万吨美国柠檬酸年产量约25万吨66微生物发酵机制

柠檬酸发酵微生物

黑曲霉分生孢子头67微生物发酵机制柠檬酸发酵机理TCA循环与乙醛酸循环柠檬酸积累的代谢调节柠檬酸积累机理68微生物发酵机制磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413TCA循环与乙醛酸循环柠檬酸合成酶ATP降低限速反应延胡索酸酶关键酶α-酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶69微生物发酵机制磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413TCA循环与乙醛酸循环反馈抑制苹果酸脱氢酶CO2参与嘌呤和嘧啶的合成脂肪酸天冬氨酸参与蛋白质合成参与蛋白质合成丙酮酸脱氢酶70微生物发酵机制葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoACO2柠檬酸的生物合成途径实现柠檬酸积累：一、设法阻断代谢途径，实现柠檬酸的积累二、代谢途径被阻断部位之后的产物，必须有适当的补充机制CO2ATPADPCO2ADPATP磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶顺乌头酸酶抑制剂阻断71微生物发酵机制柠檬酸发酵机理葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoACO2柠檬酸的生物合成途径顺乌头酸酶抑制剂阻断72微生物发酵机制柠檬酸积累的代谢调节

糖酵解及丙酮酸代谢的调节黑曲霉在缺锰的培养基中培养时，可提高NH4+浓度，高浓度NH4+可有效解除ATP、柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制。73微生物发酵机制葡萄糖葡萄糖-6-磷酸ATPADP⑴果糖-6-磷酸ATPADPMg2+⑵果糖-1，6-二磷酸⑶甘油醛-3-磷酸二羟丙酮磷酸⑷⑸2Pi⑹1，3-二磷酸甘油酸2ADP2ATP⑺3-磷酸甘油酸⑻2-磷酸甘油酸2H2OMg2+⑼磷酸烯醇式丙酮酸2ATP2ADP⑽烯醇式丙酮酸丙酮酸乳酸⑾2CO2乙醛+2H+⑿⒀2NAD+2(NADH+H+)+2H+乙醇⒁糖酵解和酒精发酵的全过程磷酸果糖激酶AMP无机磷NH4+活化抑制解除柠檬酸74微生物发酵机制柠檬酸积累的代谢调节三羧酸循环的调节柠檬酸×顺乌头酸×异柠檬酸∵顺乌头酸酶含铁的非血红蛋白，以Fe4S4作为辅基。且反应需要Fe++∴１适量加入亚铁氰化钾（黄血盐），与Fe++生成络合物，则酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。∴２诱变或其他方法，造成生产菌种顺乌头酸酶的缺损或活力很低，同样积累柠檬酸。75微生物发酵机制磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰辅酶A柠檬酸顺乌头酸衣康酸异柠檬酸草酰琥珀酸α－酮戊二酸谷氨酸琥珀酰辅酶A琥珀酸延胡索酸葡萄糖苹果酸草酰乙酸乙醛酸乙酰辅酶A123316451567891012111413TCA循环与乙醛酸循环CO2柠檬酸合成酶高能硫酯键能量Fe2+Fe2+亚铁氰化钾顺乌头酸酶76微生物发酵机制葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA柠檬酸积累的代谢调节及时补加草酰乙酸外加草酰乙酸回补途径旺盛的菌种组成型的丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶回补途径顺乌头酸酶抑制剂阻断77微生物发酵机制柠檬酸积累的代谢调节糖酵解及丙酮酸代谢的调节三羧酸循环的调节及时补加草酰乙酸葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸乙酰CoA丙酮酸羧化酶回补途径丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸顺乌头酸酶抑制剂阻断78微生物发酵机制

1、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高，促进了EMP途径的畅通。2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。

柠檬酸积累机理黑曲霉79微生物发酵机制柠檬酸积累机理3、在控制Fe++含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：780微生物发酵机制4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ和丙酮酸固定CO２反应相平衡柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。

柠檬酸积累机理葡萄糖苹果酸柠檬酸草酰乙酸顺乌头酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA丙酮酸羧化酶回补途径81微生物发酵机制柠檬酸积累机理5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。柠檬酸×顺乌头酸×异柠檬酸×草酰琥珀酸82微生物发酵机制目的产物提供4C化合物TCA循环83微生物发酵机制

由于TCA循环降低，ATP的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK的抑制。柠檬酸发酵需要下述环境条件：磷酸盐浓度低；氮源为NH4+盐；pH值低（低于2.0）；溶氧量高；Mn2+、Fe2+、

Zn2+含量极低。柠檬酸发酵中黑曲霉对Mn2+极端敏感。黑曲霉在缺锰的条件下发酵，细胞有生理和代谢的变化。Mn2+的效应可以认为是NH4+水平升高而减弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。84微生物发酵机制

柠檬酸积累机理

1、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+浓度升高，促进了EMP途径的畅通。2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。3、在控制Fe++含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：785微生物发酵机制

第二节醋酸发酵机制淀粉糖酒精醋酸1.醋杆菌发酵酒精成醋酸乙醇向醋酸转化是分两步进行的，中间产物是乙醛。CH3CH2OHE1

CH3CHOE2

CH3COOH

E1乙醇脱氢酶或乙醇氧化酶，它依赖于NAD。

E2乙醛脱氢酶，需要NADP作辅酶。

醋杆菌为G-，好氧菌，1mol乙醇转化为1mol醋酸，理论转化率是130％。86微生物发酵机制

2热醋酸梭菌生产醋酸热醋酸梭菌在发酵糖类时，由糖到醋酸一步完成，还可以将CO2还原为醋酸。CO2是通过甲酰四氢叶酸（THF）和类咕啉蛋白形成醋酸的。但该菌没有氢化酶活性，不能利用氢气。C6H12O6+2H2O2CH3COOH+2CO2+8H++8e

2CO2+8H++8eCH3COOH+2H2O净反应C6H12O63CH3COOH反应在厌氧条件下进行的，由己糖或戊糖生成醋酸的理论产率都是100％。热醋酸梭菌为产芽孢菌，Ｇ＋，周生鞭毛，耐高温，最适生长温度55～60°C，转化率高，严格厌氧，还可以利用戊糖。但这种方法发酵时需中和剂，因此只适合于醋酸盐。

87微生物发酵机制第三节谷氨酸发酵机制

氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵。由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。也就是说，氨基酸发酵的关键是取决于其控制机制是否能够被解除，是否能打破微生物的正常代谢调节，人为地控制微生物的代谢。88微生物发酵机制一.谷氨酸生物合成途径

谷氨酸的生物合成途径有EMP途径、HMP途径、TCA循环、乙醛酸循环和CO2固定反应。葡萄糖先生成谷氨酸，依次经鸟氨酸，谷氨酸生物合成精氨酸。谷氨酸的生物合成途径如图所示。89微生物发酵机制90微生物发酵机制三.谷氨酸发酵的代谢控制

谷氨酸发酵的代谢控制一般采取下列措施。1．控制发酵的环境条件氨基酸发酵受菌种的生理特征和环境条件的影响，对专性好氧菌来说，环境条件的影响更大。谷氨酸发酵必须严格控制菌体生长的环境条件，否则就几乎不积累谷氨酸。谷氨酸生产菌因环境条件改变而引起的发酵转换，这也就是说氨基酸发酵是人为地控制环境条件而使发酵发生转换的一个典型例子。91微生物发酵机制

2．控制细胞膜渗透性在发酵过程中，控制使用那些影响细胞膜通透性的物质，有利于代谢产物分泌出来，从而避免了末端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。以葡萄糖为原料，利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸时，谷氨酸生产菌为α-酮戊二酸脱氢酶缺失突变株，当谷氨酸的合成达到50mg/g（干细胞）时，由于反馈调节作用，谷氨酸的合成便终止。如果改变细胞膜通透性，使胞内代谢产物谷氨酸渗透到胞外，有利于提高发酵产量。

92微生物发酵机制

所以代谢产物的细胞渗透性是氨甚酸发酵必须考虑的重要因素。对于谷氨酸发酵来说，生物素是谷氨酸发酵的关键物质。当细胞内的生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，因而得不到谷氨酸。谷氨酸发酵生产中，谷氨酸生产菌属于生物素缺陷型菌种，生物素作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。93微生物发酵机制

因而可以通过限量控制生物素的含量，也就是通过控制生物素亚适量，提高细胞膜的渗透性。

在发酵的前期，满足细胞的生长，合成完整的细胞膜；中期生物素耗尽，细胞膜合成不完整，完成长菌型细胞向产酸型细胞的转变，细胞膜的渗透性增加，使得谷氨酸渗透到细胞外，在细胞内谷氨酸达不到引起反馈调节的程度，从而使谷氨酸能够源源不断被优先合成。

94微生物发酵机制

影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质可分为两大类：一类是生物素、油酸和表面活性剂，其作用是引起细胞膜的脂肪酸成分或量的改变，尤其是改变油酸含量，从而改变细胞膜通透性；另一类是青霉素，其作用是抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。另外，代谢控制还包括控制支路代谢，消除终产物的反馈抑制和反馈阻遏等等。95微生物发酵机制

第五节抗生素发酵机制

次级代谢产物---(secondarymetabolite)分解代谢：将从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质降解，为细胞的生命活动提供能源和小分子中间体。如TCA、EMP和HMP等。合成代谢：利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。代谢类型96微生物发酵机制一.初级代谢和次级代谢初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。次级代谢：某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素，其它还有氨基糖、香豆素、麦角生物碱、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉等。97微生物发酵机制

二、微生物合成抗生素与初级代谢的关系

1.从代谢方面分析：许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切联系的。糖代谢的中间体，既可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体，如丙二酰CoＡ。

G乙酰CoＡ丙二酰CoA脂肪酸（初级）

四环素或其他抗生素（次级）98微生物发酵机制

初级代谢和次级代谢的分叉中间体分叉中间体初级终点产物次级终点产物氨基己二糖赖氨酸青霉素,头孢酶素丙二酰CoＡ脂肪酸四环素族,利福霉素族乙酰CoＡ大环内酯族,多烯族抗生素莽草酸对氨基苯丙氨酸氯霉素,绿脓菌素苯丙氨酸,酪氨酸新生霉素99微生物发酵机制由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种：葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其它复合途径。100微生物发酵机制

2.从遗传方面分析：

初级产物和次级产物同样都受到核内DNA的调节控制的。所不同的是次级代谢产物还受到“与初级代谢产物合成无关的遗传物质”的控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制,因而产生了质粒遗传的观点。当然也有只由染色体DNA控制的抗生素。因此，两者在遗传上既有相同的部分，又有不同的部分。

101微生物发酵机制

三抗生素生产菌的主要代谢调节机制

受DNA控制的酶合成的调节机制，包括酶的诱导和酶的阻遏（有终点产物和分解产物）；

酶活性的调节机制，包括终点产物的抑制或活化，利用辅酶的酶活调节、酶原的活化和潜酶的活化；

细胞膜透性的调节；

微生物的代谢调节机制可从DNA水平研究酶合成的调节机制和从酶化学观点研究酶活性的调节机制两方面着手，可分为：102微生物发酵机制

微生物体内的次级代谢和初级代谢一样，都受菌体代谢的调节。次级代谢产物生物合成的调节与初级代谢产物生物合成的调节在某些方面是相同的，也是调节参与生物合成的酶合成（诱导或阻遏）和控制酶活性（激活或抑制）。但次级代谢的调节也有其独特的一面。以下是影响抗生素合成的主要代谢调节机制。103微生物发酵机制1初级代谢对次级代谢的调节

次级代谢产物的合成途径并不是独立存在的，而是与初级代谢产物合成途径间存在着紧密的联系。次级代谢产物往往都是以初级代谢产物为母体衍生而来的，而且催化特殊次级代谢产物合成反应的酶也可以从那些初级代谢途径的酶演化而来。因此，微生物的初级代谢对次级代谢具有调节作用。

104微生物发酵机制

当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体α-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制α-氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。105微生物发酵机制2碳代谢物的调节

一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物的生物合成都表现出抑制作用。这种抑制作用并不是由于快速利用碳源直接作用的结果，而是由于其代谢过程中产生的中间产物引起的。这种阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。106微生物发酵机制3氮代谢物的调节

许多次级代谢产物的生物合成同样受到氮分解产物的影响。对不同氮源的研究发现，黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；而以无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源（铵盐、硝酸盐、某些氨基酸）时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。例如，易利用的铵盐有利于灰色链霉菌迅速生长，但对链霉素合成则是最差的氮源。108微生物发酵机制4磷酸盐的调节

磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。

109微生物发酵机制

★已发现过量磷酸盐对四环素类、氨基糖苷类、多烯类和大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在适当的磷酸盐浓度下才能进行。磷酸盐浓度≥10mmol/L往往对次级代谢产物的合成有抑制作用例如，10mmol/L的磷酸盐就能完全抑制杀假丝菌素的合成。110微生物发酵机制★磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。如金霉素、万古霉素等的发酵都有这些现象。★磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。111微生物发酵机制5ATP调节

ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。在四环素的生