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核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆 的筛选酶切的制作、 组中特定 序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的DNARNA分子所处的位置。根据被测定的对象,分子杂交基本可分为以下几大类:DNADNA或总RNA一、选择题1、B(1、B(必需氨基酸指的是自身不能合成或合成速度不能满足需要,必须从食物中摄取的氨基酸。对成人来说,这类氨基酸有8种,包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸。对婴儿来说,组氨酸和精氨酸也是必需氨基酸。2、A.(Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNARNA)(1(1)Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,DNARNA(2(2)Northern杂交:RNARNA,DNARNA通过增加底物浓度可以逆转的一种酶抑制类型。一个竞争性抑制剂通常与正常的底物或配体竞争同一个蛋白质的结合部位。这种通过增加底物浓度可以逆转的一种酶抑制类型。一个竞争性抑制剂通常与正常的底物或配体竞争同一个蛋白质的结合部位。这种抑制使得KmVmax若在反应体中存在与底物类似的物质,该物质也能在酶的活性部位上结合,从而阻碍酶与底物的结合,使酶催化底物反应速率下降。特点:抑制剂与底物竞争酶的活性部位,当抑制剂与酶的活性部位结合后,底物就不能再与酶结合,同样反之。竞争性抑制的机理抑制剂与底物在结构上有类似之处可能结合在底物所结合的位点(如结合基团)上,从而阻断了底物和酶的结合降低酶和底物的亲和力。注意:结合在酶的同一部位以及结构类似并不是竞争性抑制的必要条件,抑制剂结合的部位阻碍底物和酶的结合,即产生空间位阻也可以造成竞争性抑制。1、D(竞争性抑制KmVmax4、D(组织缺氧程度与血液中COHbHb的百分比例有关系((。 西医病因病理带氧气的能力。一氧化碳与血红蛋白的亲和力比氧与血红蛋白的亲和力大约300的解离慢约3600倍,而且碳氧血红蛋白的存在还抑制氧合血红蛋白的解离,阻抑氧的释放和传递,造成机体急性缺氧血症。高浓度的一氧化碳还能与细胞色素氧化酶中的二价铁相结合,直接抑制细胞内呼吸。组织缺氧程度与血液中COHbHb的百分比例有关系。血液中COHb%与空气中CO系。时,体内血管吻合枝少而代谢旺盛的如脑和心最易损害。脑内小血管迅速麻痹、扩张。脑内三磷酸腺苷(ATP)在无氧情况下迅速耗尽,钠泵运转不灵,钠离子蓄积于细胞内而诱发脑细胞内水肿。缺氧使血管内皮细胞发生肿胀而造成脑血管循环 。缺氧时,脑内酸性代谢产物蓄积,使血管通透性增加而产生脑细胞间质水肿。脑血循 可造成血栓形成、缺血性坏死以及广泛的脱髓鞘病变阴离子交换基质结合带有负电荷阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。5、D(c-b-(pH6.5DEAE-pH条件下,肌红蛋pl4.6的卵清蛋白,因为它此时正电性强,被阳离子吸附的最牢。DEAE-纤维素DEAEDEAE-纤维素DEAEcellulose为二乙氨乙基纤维素。是阴离子交换纤维一。DEAE—纤维素的活化:称取IgDEAE3252,放入5ml量筒中,加蒸馏水浸泡过夜,观察溶胀后DEAE的体积。根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAEDEAE用蒸馏水浸泡过夜,其间换几次水,每次除去细小颗粒。抽干,改用0.5ml/LNaOH溶液浸泡1h以上,抽干(可用布氏漏斗),用无离子水漂洗,使pH8左右(pH试纸检查)。再改用0.5ml/LHCl1h以上,去酸溶液,用无离子水洗至pH6左右。本实验中在用前应以0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,浸泡平衡后使用。 就是使交换剂带上所希望的某种离子,如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡,如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后用0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可 以HPO4取代DEAE中的OH—一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白,所以再生时,先用0.5ml/LNaOH浸洗,用去离子水洗至pH8左右,再 离子交换层析离子交换层析(IonExchangeChromatographyIEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。6、D6、D需要引物分子参与的生物合成反应有:糖原合成(糖原合成酶催化的糖原合成反应不能从头开始合成第一个糖分子,需要至少含4个葡萄糖残基的α-14-多聚葡萄糖作为引物(ketonebody):在肝脏中,脂肪酸氧化分解的中间产物乙酰乙酸、β产生的条件在饥饿期间是包括脑在内的许多组织的,因此具有重要的生理意义。外的物质无法进入脑为脑组织提供能量。饥饿时可占脑能量来源的25%-75%过多会导致。避免过多产生,就必须充分保证糖供给。合成两个乙酰辅酶A被硫解酶催化生成乙酰乙酰辅酶A。β-A乙酰乙酰辅酶A与一分子乙酰辅酶Aβ-羟基-β-甲基戊二酰辅酶AHMGA合成酶催化。HMGA裂解酶将其裂解为乙酰乙酸和乙酰辅酶AD-β-NADHβL-型底物。5。脂肪的生物合成脂肪的生物合成脂肪的生物合成包括三个方面:饱和脂肪酸的从头合成,脂肪酸碳链的延长和不饱和脂肪酸的生成。脂肪酸从头合成的场所是细胞液,需要CO2和柠檬酸的参与,C2供体是糖代谢产生的乙酰CoA。反应有二个酶系参与,分别是乙酰CoA羧化酶系和脂肪酸合成酶系。首先,乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶催化下生成,然后在脂肪酸合成酶系的催化下,以ACP作酰基载体,CoAC2受体,丙二酸单CoAC2供体,经过缩合、还原、脱水、再还原几个反应步骤,先生成含4个碳原子的每次延伸循环消耗一分子丙二酸CoA、两分子NADPH,直至生成软脂酰ACP。产物再活化成软CoA,参与脂肪合成或在微粒体系统或线粒体系统延长成C18、C20和少量碳链更长的脂肪酸。在真核细胞内,饱和脂肪酸在O2的参与和专一的去饱和酶系统催化下,进一步生成各种不饱和脂肪酸。高等动物不能合成亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸,必须依赖食物供给。3-3-磷酸甘油与两分子脂酰CoA在磷酸甘油转酰酶作用下生成磷脂酸,在经磷酸酶催化变成二酰甘油,最后经二酰甘油转酰酶催化生成脂肪。糖原的合成磷酸戊糖途径:指机体某些组织以磷酸戊糖途径:指机体某些组织以6-磷酸葡萄糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6酸葡萄糖进而代谢生成磷酸戊糖为中间代谢物的过程,又称为磷酸己糖旁路。77、B.6-磷酸-葡萄糖(注意:①c,6P是糖代谢各种途径的交汇点;CoA是三大物质代谢的交汇点。③coQ是线粒体中不同的底物氧化呼吸链的交汇点。酮酸,α酮戊二酸氨化为非必须氨基酸。氨基酸可以转化为糖除生酮氨基酸外,生糖,生糖兼生酮氨基酸甘油能转变为某径(这是体内利用5-磷酸核糖的唯一途径);VLDL极低密度脂蛋白:是内源性甘油三酯的主要形式脂蛋白位的胆固醇从头合成。脂蛋白位的胆固醇从头合成。组织,并调节这些部血浆壳层中也含apoB-100,它被靶细胞所识别。LDL的功能是转运胆固醇到外面包围着磷酸脂和未酯化的胆固醇胆固醇壳层,1500个胆固醇酯分子LDL低密度脂蛋白血浆脂蛋白的一种,是血液中胆固醇的主要载体。其VLDL极低密度脂蛋白:是VLDL极低密度脂蛋白:是内源性甘油三酯的主要形式。正常人极低密度脂蛋白大部分代谢变成低密度脂蛋白。这类脂蛋白由于携带胆固醇数量相对较少,且它们的颗粒相对较大,不易透过血管内膜,因此,正常的极低密度脂蛋白没有致动脉硬化作用,像乳糜微粒一样也不是冠心病的主要因素,极低密度脂蛋白代谢产生的中密度脂蛋白具有致动脉硬化作用。ApoCLPL,并水解TGHDLLCATCETPVLDLVLDL9.D.C4,C3N2
调节,因此种调节使反应加速的叫正反馈;如使反应的为负反馈。(一)别构调节(allosteric变化,不涉及共价键变化。受别位调节的酶又称别位酶(别构酶--allostericenzyme)。例:蛋白激酶A2C,2RCRcAMPRCRcGMP4、别构酶的反应动力学特点:反应曲线呈S剩,使多余能源合成。⑶调节能量代谢的平衡。CoA(二)酶的化学修饰(chemicalmodification)酶蛋白肽链上的某些基团,在另一种酶的催化下发生可逆的共价修饰(covalentmodification),从而酶蛋白的磷酸化是在蛋白激酶(proteinkinase)ATP则是磷蛋白磷酸酶(proteinphosphatase)催化的水解反应。此酶存在两种形式:无活性的ba磷酸化的糖原合成酶D(无活性),脱磷酸化的糖原合成酶I(有活性)无有1:肌肉中磷酸化酶bAMPa↑。2:不易受磷酸酶作用脱去p,使磷酸化酶a1、α1、α螺旋:蛋白质分子中多个肽键平面通过氨基酸α碳原子的旋转,使多肽链的主骨架沿中心轴成稳定的α螺旋构象。αββDNA一碳单位具有以下下两个特点:1.不能在生物体内以游离形式存在;2.必须以四氢叶酸为载体。一碳单位具有以下下两个特点:1.不能在生物体内以游离形式存在;2.必须以四氢叶酸为载体。能生成一碳单位的氨基酸有:丝氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸。另外蛋氨酸(甲硫氨酸)可通过S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供“活性甲基”(一碳单位),因此蛋氨酸也可生成一碳单位。一碳单位的主要生理功能是作为嘌呤和嘧啶的合成原料,是氨基酸和核苷酸联系的纽带。所以一碳单位缺乏时对代谢较强的组织影响较大,例如:红细胞,导致巨幼性贫血。是含一个碳原子的基团,如甲基(-CH3)、羟甲基(-CH2OH)、甲酰基(-CHO)、亚氨甲酰基(-CH=NH)、甲烯基(-CH2-)、甲炔基(-CH=)。它们不能独立存在,必须以四氢叶酸为载体,从一碳单位的供体转移给一碳单位的受体,使后者增加一个碳原子。丝氨酸、甘氨酸、色氨酸和组氨酸在代谢过程中可生成一2、一碳单位:就是指具有一个碳原子的基团。指某些氨基酸分解代谢过程中产生含有一个碳原子的基团,包括甲基、亚甲基、甲烯基、甲炔基、甲酚基及亚氨甲基等。碳单位,作为供体,主要用于嘌呤核苷酸从头合成、脱氧尿苷酸碳单位,作为供体,主要用于嘌呤核苷酸从头合成、脱氧尿苷酸5酸甲基化再生蛋氨酸。2、药物2、药物组学遗传组学遗传组学(geneticalgenomics)是将微阵列技术和数量性状座位(QTL)分析结合起来,全组水平上定位QTL(eQTL.它为研究复杂性状的分子机理和调控网络提供全新的.3、3、ADPATP氧化磷酸化(oxidativephosphorylation)ATPATPADPATP一、偶联部位:根据实验测定氧的消耗量与ATP的生成数之间的关系以及计算氧化还原反应中和电极电位差ΔE的关系可以证明。P/O比值是指代谢物氧化时每消耗1摩尔氧原子所消耗的无机磷原子的摩尔数,即合成ATP尔数。实验表明,NADH在呼吸链被氧化为水时的P/O2.52.5ATP;FADH2P/O1.51.5ATP二、胞液中NADH糖代谢中的三和脂肪酸β-氧化是粒体内生成NADH(还原当量),可立即通过电子传递链进行氧化磷酸化。在细胞的胞浆中产生的NADH,如糖酵解生成的NADH则要通过穿梭系统(shuttlesystem)NADH的氢进入线粒体内膜氧化。(一)α-磷酸甘油穿梭作用这种作用主要存在于脑、骨骼肌中,载体是α-磷酸甘油。胞液中的NADHα-磷酸甘油脱氢酶的催化下,使磷酸二羟还原为α-磷酸甘油,后者通过线粒体内膜,并被内膜上的α-磷酸甘油脱氢酶(FAD为辅基)催化重新生成磷酸二羟FADH2,后者进入琥珀酸氧化呼吸链。葡萄糖在这些组织中彻底氧化生成的ATP1G→36ATP。(二)苹果酸-天冬氨酸穿梭作用主要存在肝和心肌中。1G→38胞液中的NADH在苹果酸脱氢酶催化下,使草酰乙酸还原成苹果酸,后者借助内膜上的α-酮戊二酸载体进入线粒体,又 粒体内苹果酸脱氢酶的催化下重新生成草酰乙酸和NADH。NADH进入NADH氧化呼吸链,生成3分子ATP。草酰乙酸经谷草转氨酶催化生成天冬氨酸,后者再经酸性氨基酸载体转运出线粒体转变成草酰乙酸。三、氧化磷酸化偶联机制(一)化学渗透假说(chemiosmotic1961年,英国学者PeterMitc 提出化学渗透假说(1978年获 化学奖),说明了电子传递释出的能量用于形成一种跨线粒体内膜的质子梯度(H+梯度),这种梯度驱动ATP的合成。这一过程概括如下:NADH的氧化,其电子沿呼吸链的传递,造成H3H+泵,即NADH脱氢酶、细胞色素bc1复合体和细胞色素氧化酶从线粒体基质跨过内膜泵入膜间隙。H+泵出,在膜间隙产生一高的H+浓度,这不仅使膜外侧的pH较内侧低(pH),而且使原有的外正内负的跨膜电位增高,由此形成的电化学质子梯度成为质子动力,是H+的化学梯度和膜电势的总和。H+通过ATP合酶流回到线粒体基质,质子动力驱动ATPATP(二)ATP合酶ATP合酶由两部分组成(Fo-F1),球状的头部F1突向基质液,水溶性。亚单位Fo埋在内膜的底部,是疏水性蛋白,构成H+通道。在生理条件下,H+只能从膜外侧流向基质,通道的开关受柄部某种蛋白质的调节。四、影响氧化磷酸化的因素(一)抑制剂能阻断呼吸链某一部位电子传递的物质称为呼吸链抑制剂。鱼藤酮、安密妥在NADH脱氢酶处抑制电子传递,阻断NADHFADH2的氧化仍然能进行。抗霉素A抑制电子在细胞色素bc1复合体处的传递。化物、CO、叠氮化物(N3-)抑制细胞色素氧化酶。对电子传递及ADP磷酸化均有抑制作用的物质称氧化磷酸化抑制剂,如寡霉素。(二)解偶联剂 酚(DNP)和颉氨霉素可解除氧化和磷酸化的偶联过程,使电子传递照常进行而不生成ATP。的作用机制是作为H+的载体将其运回线粒体内部,破坏质子梯度的形成。由电子传递产生的能量以热被释出。(三)ADP的调节作用正常机体氧化磷酸化的速率主要受ADP水平的调节,只有ADP被磷酸化形成ATP,电子才通过呼吸链流向氧。如果ADPADP的浓度下降,电子传递进行,ATP在合成,但电子传递随ADP浓度的下降而减缓。此过程称为呼吸控制,这保证电子流只在需要ATP合成时发生。五、氧化磷酸化作用氧化磷酸化作用是指有机物包括糖、脂、氨基酸等在分解过程中的氧化步骤所释放的能量合成的过程。在真核细胞中,氧化磷酸化作用 粒体中发生,参与氧化及磷酸化的体系以复合体的形式分布 粒体的内膜上,构成呼吸链,也称电子传递链。其功能是进行电子传递、H^+传递及氧的利用,产生H2O和ATP扩展:这种复合体一般有四个部分组成:复合体1.NADH-Q还原酶,复合体2.琥珀酸—Q还原酶.复合体3.细胞色素还原酶.4细胞色素氧化酶。电子在电子载体的传递过程为:NADHFADH2--Q(泛醌)——细胞色素c——O2(形成水和ATP的过程)5、酶的活性中心5、酶的活性中心:酶分子中氨基酸残基的侧链有不同的化学组成。其中一些与酶的活性密切相关的化学基团称作酶的必需基团(essentialgroup)。这些必需基团在一级结构上可能相距很远,但在空间结构上彼此靠近,组成具有特定空间结构的区域,能和底物特异结合并将底物转化为产物。这一区域称为酶的活性中心(activecenter)或活性部位(active酶的活性单位:酶的活性单位指在一定的作用条件下,酶促反应中单位时间内作用物的消耗量或产物的生成量。二、简答题1、什么是蛋白质的变性?变性的本质是什么?蛋白质变性有哪些特征?答:蛋白质的变性:在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下,蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来.这种凝结是不可逆的,不能再使它们恢复成原来的蛋白质.蛋白质的这种变化答:蛋白质的变性:在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下,蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来.这种凝结是不可逆的,不能再使它们恢复成原来的蛋白质.蛋白质的这种变化叫做变性.2.变性的本质:破坏非共价键和二硫键,不改变蛋白质的一级结构。蛋白质或核酸分子中除了连接氨基酸或如酶不再具有催化活性.,易沉淀。pH而沉淀pH度增大,蛋白质变性后,就失去了原有的可溶性,也就失去
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