超薄切片技术课件

第四章

超薄切片技术一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超薄切片技术概述第一节基本概念三、扫描电镜样品制备技术一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度又取决于样品制备技术1、决定电镜图像分辨率的两个因素2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理3）样品厚度要适宜4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术

1、表面镀金（喷镀）技术2、组织导电技术3、冷冻断裂技术4、离子蚀刻技术5、临界点干燥技术6、冷冻干燥技术7、铸型观察技术（复型）

注：最基本、最经典的还是超薄切片技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制备技术四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm之间的切片为～石蜡切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM专用，一般500～700Å2、制作超薄切片的必要性1).增加电子透射能力2).电镜的场深大，切片太厚，上下结构重叠,使得图像不清楚3).减少色差4).减少样品对电子的吸收⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应⑵

切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å太薄：高，反差低太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至不能穿透⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀3、对超薄切片的要求取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色4、超薄切片制备的一般程序：第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四渗透与包埋五超薄切片六电子染色操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)⑴快：动作迅速,快取,投入固定液⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4⑶

冷：0～4℃⑷

准：取的部位准，有代表性、目的性⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压一、取材1、含义指从生物体上取下要观察的组织块。2、取材操作规则注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶⑴动物材料麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）在预冷的玻板上细切（1mm3）

→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定(1～2h)⑵植物材料叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡根茎果实1mm3⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为：⑴野外取材：冰壶⑵实验室室内取材1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法：锇酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、

重铬酸钾、丙烯醛物理方法：冷冻，干燥，高温二、固定（一）固定的基本知识⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分⑶使其在电镜下有良好的电子反差3、固定的目的4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集1）组成：固定液：固定剂＋缓冲液2）作用：⑴破坏细胞的酶活性系统⑵稳定细胞物质成分，并保存之⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型⑸提供一定的电子反差5、固定液的作用1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4)

能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)

最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件优点：

⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)锇酸缺点：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小⑷固定时间不宜过长⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积⑹有挥发性、剧毒2）戊二醛（

C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较强的亲和力⑶可长时间固定（<7天），适于野外取材⑷不易使酶失活，适于细胞化学研究⑸不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有刺激性

戊二醛缺点：⑴不保存脂肪⑵无电子染色作用⑶对缓冲液的要求严格很差很好糖元良好很好好锇酸很差很好尚好戊二醛脂类核蛋白蛋白质固定剂不强有小很差强无大较好对BS的选择性电子染色渗透核酸四氧化锇与戊二醛的固定作用比较锇酸戊二醛固定剂双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。3)甲醛（HCHO）：甲醛＋戊二醛

滲透速度快、固定迅速，对酶活性的保护优于戊二醛，经济方便4)高锰酸钾（KMnO4)

磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结构、叶绿素固定良好。1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用⑴维持稳定的pH值⑵提供适当的渗透压⑶提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂：调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三）缓冲液和附加剂储备A液(0.2M):磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml储备B液(0.2M):磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml

0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。

优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置

缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染pH（25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5⑴．磷酸盐缓冲液4、常用缓冲液⑵．巴比妥盐对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存⑶．二钾胂酸盐可长期保存，有毒，有臭味（四）、固定1、固定液的配制⑴单固定：

戊二醛或锇酸单次固定1～3小时⑵双固定：

前固定（戊），漂洗，后固定（锇）⑶多重固定：用三种以上的固定剂对样品进行固定

2、固定的方法1）按固定液的成分划分为：2）按固定方式分为：

a.浸泡固定b.体外固定

c.原位固定d.灌流固定固定操作示意图漂洗操作方法1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂2)固定液的渗透压：渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀渗透压高→细胞收缩3)pH值：植物6.8～7.1,动7.2～7.44)固定的温度：0～4℃但低温对细胞微丝、微管有害5)组织块的大小：0.5～1mm36)固定液的用量，一般为组织块的500倍3、固定注意事项：三脱水(dehydrate)1.定义：用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分的过程。2.脱水的原因：⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水；⑵湿样品反差低、必须干燥；⑶含水样品在高真空下容易被破坏。3.脱水的原则：逐级梯度脱水(80%及以前4℃)30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％环氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min)4.常用的脱水剂：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5.脱水注意事项:⑴脱水要彻底⑵更换液体动作要迅速⑶脱水时间不宜过长⑷固定后的样品要充分漂洗附加步骤：块染（BlockStaining)块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）脱水前染色：双固定→漂洗→

0.5％~4%的醋酸双氧铀染色，1h,4℃→脱水脱水时染色：脱水至70％乙醇→硝酸铅的70％乙醇饱和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→继续脱水四渗透与包埋

目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质的超薄切片。步骤：渗透，包埋，聚合（一）、渗透（Infiltrate)渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充。脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂脱水剂:包埋剂＝3:1→1:1→1:3→纯包埋剂

渗透时间表(小时）脱水剂：包埋剂动物材料植物材料体外培养细胞3：1110.51：11～41～120.5~11：31～22～120.5包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。（二）、包埋(embedding)1、包埋剂应具备的条件:⑴聚合有良好的切割性能，软硬度易调节⑵粘度低,易渗透⑶溶于脱水剂⑷电子透明度好,并具有一定的反差⑸聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低⑹本身无结构⑺热稳定性好,可耐电子束轰击⑻来源丰富，且各批号性能尽可能一致⑼切片易染色,且对人体无害2、常用包埋剂1)甲基丙烯酸酯

优点：分子量小，粘度低,易渗透；,硬度易调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差好；无毒性，便宜

缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2)聚酯树脂

优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，

缺点：不稳定，易脆裂3）水溶性包埋剂

常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA)

注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需紫外照射

应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究4)环氧树脂类包埋剂：

特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用

常用试剂：Epon-812,国产618，ERL－4206

Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软

MNA（六甲酸酐），块硬3.常用配方：

⑴Epon-812配方（1961，Luft)A液：Epon－8125mlDDSA8mlB液：Epon－8125ml

MNA7ml

最终：A液13，B液15，DMP-3016滴（1~2%）夏天：A：B=2：8（A多软）冬天：A：B=1：9（B多硬）（2）国产618配方:

61812ml+DDSA8ml+DBP(增塑剂，苯二甲酸二酯丁）0.6～1.6ml+DMP-300.2～0.4ml(1～3滴）（3）

ERL-4206:低粘度,易渗透4,包埋方法:常规包埋:定向包埋:浅槽包埋、二次包埋、加条包埋（三）、聚合37℃（12h)→45℃(12~48h)→60℃(24~48h)（四）、注意事项1、一切器材均须烘干2、配制包埋剂时，逐项加入试剂并搅拌3、做好的包埋块置于干燥器中4、配制包埋剂不宜长时间存放，室温下也有一定程度聚合渗透、包埋、聚合操作图五超薄切片A.载网:

1、作用：承载样品,以便后续染色和观察

2、分类

从材料:铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢,尼龙，碳

形状上分:圆型,蜂窝,正方形,长方形单孔型,狭逢型

大小:d=2～3mm,h=0.1mm

目：一英寸的线段上具有的孔的数目常用180～230目（让70％电子束通过）（一）、载网和支持膜3、载网的特点大孔径(目数少)：电子透过率高，支持性差，在低倍、分辨率低、大视野场合下使用小孔径(目数多)：反之4、载网的清洗：

目的：清洁，除去静电

新网：丙酮或乙醇浸洗，双水洗

旧网：溶膜→酸碱,超声,离子蚀刻点击返回B.支持膜的制备

1、特点:①本身无结构②电子透明度高③机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好④不与样品发生反应⑤厚度适中,150Å

2、常用支持膜①福尔莫瓦膜（Formvar):聚乙烯醇缩甲醛，0.2%~0.5%氯仿溶液，机械强度高，制作简易②火棉胶膜：强度低，制作简易，1～2％醋酸异戊酯溶液

③帕罗丁膜：30％醋酸戊酯溶液，强度稍高于火棉胶膜④碳膜：机械轻度高，化学稳定好。适于高分辨率样品，需专用仪器：

真空喷镀仪⑤复合膜：有机膜＋碳膜（50～100Å）⑥微孔支持膜(微筛)：高分辨率用哈气法、甘油法、气压法返回返回返回返回（二）、制刀1、刀的种类：玻璃刀，钻石刀2、玻璃刀的制作:①玻璃要求:硬,含硅高（72～75%),h=4～8mm，宽25mm、38mm，长30cm②步骤：洗涤玻璃条，并晾干制成小方块，对角折断检查刀刃③检查的标准：中左端平直无缺损右端稍上翘显微镜下刀刃有明亮的应力线④制刀的手段手工制刀，专用制刀机制刀（LKB7800)钻石刀（三）装水槽1.方法:

⑴装塑料模具水槽⑵自制胶带水槽2.槽液的要求⑴不与材料发生化学反应⑵干净无杂质⑶液面与刀口基本平行⑷低粘度,蒸发量小⑸有一定的表面张力,有利于漂浮切片

3.常用的槽液：双蒸水、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等玻璃刀口的选择玻璃刀、载网、包埋块及塑料模具水槽（四）修块1.目的

⑴除去组织周围多余的包埋介质和不感兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积⑵含组织块的区域和不含组织块的区域硬度不同，经过修块，尽可能除去组织块外的空白包埋介质，使要切的部分硬度一致，切出高质量的切片⑶修成一定形状、大小的包埋块截面，便于连续切片2.修块的方法

⑴手工修块：粗修：四棱台型细修：小四棱台塔型或二层四棱台型（Mesa型），顶面积<0.1mm2，四个侧面要整齐、规则

⑵机械修块：（专用修块机或超薄切片机）

先修顶面暴露样品后修四个侧面（五）、切片1、超薄切片机(Ultramicrotome)⑴按进刀原理分为：机械推进式：AO型热膨胀式：I↗膨胀↗切片厚↗

LKB(Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ），CQR－1冷缩式

⑵LKB切片机构造⑶切片的原理加热线圈→金属臂膨胀→推进样品→电动机驱动样品臂上下运动→切削2、切片操作步骤：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片返回3、切片原则：

1）刀角、前角，切速参数的选择原则：

⑴软硬适中的包埋块，45刀角，3~5前角，2~5mm/s⑵包埋块硬,小刀角,切速小；包埋块软,大刀角,切速大⑶较薄样品,切速大20mm/s

要获得较大面积的切片，切速1mm/s

2)预先制作半薄切片的原则:

⑴半薄切片的定义：切片的厚度介于普通切片和超薄切片之间的切片,0.5~2µm

⑵半薄切片的作用：精确定位样品特征位置点，并筛选包埋块返回4、切片厚度的判断颜色厚度(Å)切片厚度分辨率反差暗灰色<400Å太薄高小铅灰色400~500较薄高小银灰或银白500~700适中好好米黄、金黄700~1000较厚低好紫色(蓝)1000以上

不能用5、展片、捞片6、超切注意事项⑴切片是否成功，对刀是关键⑵槽液用新鲜的重蒸水⑶切片时的温度20~25℃，相对湿度60%，室内无空气流动，清洁，防止震动⑷不损坏封固刀槽的石蜡,否则漏水7、切片缺陷产生的原因及排除方法六、电子染色1.电子染色(ElectronStaining)1)概念:利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力