《生物工艺学》植物细胞培养技术-课件

生物工艺学

生物工艺学植物细胞培养技术2ppt课件主要内容概述植物细胞培养特性与基本培养技术有用代谢物的生产大量培养技术展望3ppt课件一、概述1抗生素的缺陷微生物来源的药品曾以青霉素的发现为契机有突飞猛进的发展,但越来越多的病原微生物如:葡萄球菌,大肠杆菌,结核杆菌等都表现出耐药性。半合成青霉素、半合成红霉素的开发表现出了巨大的应用前景,但人们对抗生素的局限性已有了深刻认识。全世界75%的人以植物为治疗,预防疾病的药物来源。4ppt课件概述（续）2植物源药物植物含有无可计数的次生代谢物，可从中筛选新的药物。紫杉醇能够治疗癌症。但紫杉醇的药物资源严重匮乏而需者甚众,即便对红豆杉进行掠夺性开发也不能满足市场的需求。紫草是我国常用的名贵中药材。在《本草纲目》中以解表凉血、清热解毒、活血化淤等广谱疗效被列为上品（以根入药）,因野生资源枯竭，供不应求。人工栽培:紫草。受季节、气候限制，病虫害侵扰。植物的细胞培养。5ppt课件3植物细胞培养历史植物细胞培养定义：在离体条件下培养植物细胞的方法。将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量细胞群体。方法：小规模的悬浮培养在培养瓶中进行；大规模者可利用发酵罐生产。6ppt课件1939年Gautheret、Nobercourt,white分别成功地培养了烟草、萝卜、杨等形成层组织。20世纪50年代，Talecke和Nickell确立了植物细胞能够成功地生长在悬浮培养物中；1956午Nickell和Routin第一个申请用植物组织细胞培养产生化学物质的专利。近1000种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的产物包括药品、香料、色素、食品、化妆品等500多种。进入中试开发或工业生产规模的还仅限于人参、紫草、红豆杉、毛地黄、烟草等。植物细胞培养历史7ppt课件植物细胞培养的应用领域有用代谢物质的生产；珍贵植物和名贵花卉等种苗的快速繁殖；进行植物细胞遗传和病毒方面的研究。魔芋试管苗8ppt课件二、植物细胞培养特性与基本培养技术1植物细胞培养特性应用细胞培养方法生产次生物质的优点次生物质的生产条件可控，产量高，占用耕地面积少，不受地域和季节的影响。在无菌条件下生长，可以排除病菌和虫害的侵扰；可进行特定的生物转化反应，得到均一的有效成分。可探索新的合成路线和获得新的有用物质9ppt课件植物细胞培养特性应用细胞培养方法生产次生物质的缺点与微生物细胞相比培养周期较长、生长缓慢、生产率低；有效成分含量不高；大量培养相对困难耐剪切、接种量大及放大后产量下降等一系列问题。解决途径通过诱导驯化等手段获得高产细胞株，优化培养条件开发新型细胞反应器的培养技术10ppt课件2基本培养技术（1）无菌操作无菌培养的组织有植物细胞、生长点、萝卜根、子房、胚珠、花丝、花柱、花瓣、花药和花粉等。组织培养使用的设备、器具和设施包括：①灭菌装置(如高温消毒锅)、无菌操作台、显微镜、天平、纯水制造装置、摇床、离心机、pH计、分光光度计…②培养容器(如三角摇瓶)、塞子(如棉花塞)、解剖刀…③恒温培养室(箱)、分析室和低温保藏室(箱)…11ppt课件（2）植物细胞培养基植物细胞培养与动物细胞培养相比，其最大的优点是植物细胞在简单的合成培养基上生长。培养基的成分无机盐类、碳源、维生素植物生长激素、有机氮源有机酸和一些复合物质12ppt课件ALS培养基13ppt课件大量元素(母液Ⅰ)

mg／LNH4NO3

33000KNO3

38000CaCl2·2H2O

8800MgSO4·7H2O

7400KH2PO4

3400微量元素(母液Ⅱ)KI

166H3BO3

1240MnSO4·4H2O

4460ZnSO4·7H2O

1720Na2MoO4·2H2O

50CuSO4·5H2O

5CoCl2·6H2O

5BMS培养基——配方及制作MS培养基含有近30种营养成分，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。每次使用时，取其总量的1/20(50mL)或1/200(5mL)，加水稀释，制成培养液。14ppt课件铁盐(母液Ⅲ)

mg／LFeSO4·7H2O

5560Na2-EDTA·2H2O

7460有机成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇

20000ⅣB烟酸

100盐酸吡哆醇(维生素B6)

100盐酸硫胺素(维生素B1)

100甘氨酸

400以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。MS培养基15ppt课件MS培养基生长调节物质MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1mg/mL)。培养基制作配制培养液

母液Ⅰ为50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5mL。2，4D5mL、NAA1mL。溶化琼脂

调pH

培养基的pH必须严格控制在5.8培养基的分装

高压灭菌16ppt课件（3）细胞大量培养主要技术愈伤组织(callus)的固体培养(solidculture)细胞或组织的液体悬浮培养(1iquid

suspensionculture)。适合工业化生产有用植物代谢物烟草植株愈伤组织再生植株悬浮培养17ppt课件大规模植物组织培养外植体愈伤组织胚状体胚芽18ppt课件建立细胞悬浮系19ppt课件植物细胞培养流程植物细胞培养与微生物细胞发酵类似，可悬浮培养。植物组织细胞的分离

次亚氯酸盐的稀溶液、福尔马林、酒精等消毒剂对植物体或种子进行灭菌消毒。愈伤组织种子发芽，组织培养，形成不定形细胞团(愈伤组织)，将此愈伤组织移入液体培养基振荡培养。继代培养试管或烧瓶等。大规模的悬浮培养用传统的搅拌罐、气升式发酵罐。20ppt课件植物细胞培养流程21ppt课件植物细胞培养系统22ppt课件三有用代谢物的生产1为何要用细胞培养技术①植物生产2万多种化学物质，远比微生物生产的种类多；②其中一些化学物质难以化学合成；③细胞培养不受地理环境、病虫害和季节等因素的影响，可以保证产物持续生产；周期短④在实验室较快进行细胞株的筛选和培养条件的优化；⑤在生物反应器中大规模培养，减少占用耕地面积，降低生产成本和提高生产率；⑥可以利用现有的或探索新的技术进行有关细胞的代谢途径和代谢规律的研究，使植物细胞合成次生代谢物朝着对人们有用的产物方向进行。23ppt课件某些有用物质含量用植物细胞培养比栽培得到的产量高24ppt课件2次生产物种类酚类化合物黄酮类单酚类醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白质氨基酸生氰甙多炔类、有机酸等25ppt课件3产品研究开发现状植物细胞培养的生产率较低，应该进行高附加值物质的生产。如由红豆杉属细胞培养来进行抗癌剂紫杉醇和紫杉烷类的生产。植物细胞培养生产有用代谢物的大规模开发事例。日本日东电工公司生产人参(20000L反应器)日本三井石油公司生产紫草宁和小檗碱(berberine)(750L反应器)美国Bethesda研究所生产磷酸二酯酶(phosphodiesterase)德国A．Nattermann＆Cie．GmbH公司生产迷迭香酸(rosmarinicacid)(75000L反应器)。正待出台的有：英国的辣椒素(capsaicin)、美国的香子兰(vanilla)代谢物以及加拿大的血根碱(sanguinarine)等在我国,对于人参中人参皂苷的生物合成方面的研究较为深入。26ppt课件4实现植物细胞培养的工业应用条件细胞株：培养细胞在遗传上稳定，以得到产量恒定的产物；产物：代谢产物要在细胞中累积而不迅速分解掉，而最好是代谢产物释放到液体培养基中；产量：能够得到产量较高的最终产物；成本：包括培养基，前体和化学提取的生产费用要低得足以给生产带来利润。27ppt课件产品举例-人参五茄科人参属，是一种最有价值的贵重药用植物之一。作用：如抗肿瘤、抗衰老、消除紧张和增强人体免疫功能活性成分：人参中的皂苷是主要的活性成分。来源：野生植物只在韩国和中国东北的一些地区。市场上的人参大多是人工栽培的人参。从播种到最终收获需5-7年时间。植物细胞培养：日东电工公司已进行人参的商业化，生产规模达到了20t。28ppt课件产品举例-紫杉醇紫杉醇是20世纪70年代由Wani等人从短叶红豆杉树皮中提取出来的具有独特抗癌作用（卵巢癌及乳腺癌）的天然产物。1992年12月被美国食品与药物管理局(FDA)批准用于治疗卵巢癌，目前已在加拿大、以色列、荷兰、英国、揶威、瑞士、瑞典等国获准上市。我国将紫杉醇作为二类新药审批，中国医学科学院药物研究所和海口制药厂于1995年10月已获得新药证书。29ppt课件红豆杉纯天然紫杉醇原料药目前主要靠从树皮等天然资源的采集和提取。每提取1kg紫杉醇要砍伐1000～2000棵树。紫杉醇的原料保障①全合成；②半合成；③栽培法；④)植物胞组织培养法；⑤真菌生产。紫杉醇30ppt课件5育种细胞株的选拔是提高代谢物生产的传统方法之一如对于用于大规模生产的人参属细胞株，除了要求皂苷含量高和稳定性好之外，还需具有较快生长速度、悬浮分散性好、对搅拌和混合剪切力有足够的抗性等特征。基因工程和代谢操作是大幅度提高代谢物生产量的很有前景的途径。31ppt课件6植物次生代谢物生产影响因子化学因子:培养基种类、无机盐类、植物激素或其类似物、诱导子；物理因子:包括光、温度、pH、氧；生物学因子:有分化、遗传形质和细胞龄；培养工程方面:反应器型式、培养方式方法。32ppt课件激素及其类似物在植物细胞培养中，生长素利分裂素对细胞生长和次生物质的合成有非常重要的影响。33ppt课件无机盐类34ppt课件诱导子(elicitor)诱导子包括生物和非生物两类。生物诱导子一般是经高压灭活的真菌细胞壁提取物，还包括一些糖原高分子、糖蛋白和低分子有机酸等。非生物诱导子包括紫外辐射、重金属离子和一些化学物质。采用诱导(elicitation)这一方法在一些场合可有效地提高代谢物的生产。找到一种合适的引发物或称诱导子是一个关键。35ppt课件光植物的光合作用需要光。对于已去分化的植物细胞来说，虽然光照不是作为能源供给，但是光源(光质)、光强和光照时间也会在一定程度上影响细胞的生理代谢，这可能跟光作为一种信号或诱发氧自由基的产生有关。36ppt课件37ppt课件氧良好的氧供应能提高培养过程的效率。如在紫苏细胞培养生产花色素过程中改善氧供应能有效提高花青素的生产量。但在有些场合也可能需要限制供氧的程度，比如在红甜菜毛状根的培养(redbeethairyrootculture)系统中，据报道溶氧枯竭(oxygenStarvation)反而有利于红色素的生产过程。38ppt课件分化与形质在植物组织细胞培养中，用分化的器官培养来生产某些特定代谢物有时具有优势。例如，用毛状根培养(hairyrootculture)的有利因素是细胞具有比较稳定的生化和遗传特性以及较高的生长速率等。在人参组织细胞培养中，除了愈伤组织和细胞培养，近年来也还考察了一些其他类型的组织培养，如胚胎组织培养和毛状根培养。胚胎组织皂苷含量较愈伤组织和细胞中皂苷含量略低或相同。而毛状根培养中皂苷含量比愈伤组织和细胞培养皂苷含量高(两倍或两倍以上)。39ppt课件细胞龄植物细胞保存方式往往是愈伤组织(固体)或摇瓶细胞(液体)继代培养。细胞继代周期(即接种细胞的细胞龄大小)对培养往往具有很大影响。40ppt课件四、大量培养技术生物反应器的选型、设计与开发反应器操作条件过程开发与反应器操作策略41ppt课件(1)生物反应器的选型、设计与开发植物细胞培养中的大多数反应器或多或少都由微生物发酵罐改装而来；反应器的选型和开发的依据供氧能力；剪切力；细胞在反应器壁上的附着状况；细胞高浓度培养时的混合状况；温度、pH及营养物质浓度的控制；细胞集团大小的控制；放大的难易程度；维持无菌状态的性能42ppt课件生物反应器（1）机械搅拌式培养系统在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；（2）气压搅拌式培养系统机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位。因此，发展出空气提升式生物反应器，缺点是搅拌不均匀。（3）旋转式培养系统控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。43ppt课件植物细胞培养反应器44ppt课件植物细胞培养反应器45ppt课件（2）反应器操作条件反应器培养中的环境因子主要包括培养基成分光照剪切供氧气体成分黏度混合46ppt课件光照47ppt课件供氧48ppt课件气体成分除氧气外，重要气体是二氧化碳和乙烯。二氧化碳是细胞生长过程中的主要代谢气体。