细胞周期(讲座)教学课件

细胞周期(讲座)1、合法而稳定的权力在使用得当时很少遇到抵抗。——塞·约翰逊2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美德。——伯克3、最大限度地行使权力总是令人反感；权力不易确定之处始终存在着危险。——塞·约翰逊4、权力会奴化一切。——塔西佗5、虽然权力是一头固执的熊，可是金子可以拉着它的鼻子走。——莎士比细胞周期(讲座)细胞周期(讲座)1、合法而稳定的权力在使用得当时很少遇到抵抗。——塞·约翰逊2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美德。——伯克3、最大限度地行使权力总是令人反感；权力不易确定之处始终存在着危险。——塞·约翰逊4、权力会奴化一切。——塔西佗5、虽然权力是一头固执的熊，可是金子可以拉着它的鼻子走。——莎士比细胞增殖(cellproliferation)细胞周期(cellcycle)细胞分裂（celldivision)一、细胞增殖(cellproliferation)的意义一个受精卵发育为初生婴儿，细胞数目增至1012个，长至成年有1014个，约200种类型,而成人体内每秒钟仍有数百万新细胞产生，以补偿血细胞、小肠粘膜细胞和上皮细胞等的衰老和死亡。◆细胞增殖(cellproliferation)是细胞生命活动的重要特征之一,是生物繁育的基础。◆单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。◆多细胞生物由一个单细胞(受精卵)分裂发育而来，细胞增殖是多细胞生物繁殖基础。◆成体生物仍然需要细胞增殖，主要取代衰老死亡的细胞,维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能◆机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等，都要依赖细胞增殖。二、细胞周期(cellcycle)◆概念：

细胞周期的概念由Howard和Pelc,在1953年提出。一次细胞分裂结束到下一次分裂完成所经历的一个有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞。也称细胞生活周期(celllifecycle)或细胞繁殖周期(cellreproductivecycle)（细胞周期是第一次分裂开始到第二次分裂开始所经历的全过程。《普通生物学》陈阅增）◆历史：

●上世纪50年代以前，有丝分裂期

（mitosis）、间期(interphase)。

●1953年Howard和Pelc用32P的磷酸盐作为标记物浸泡蚕豆发芽，取根尖作放射自显影发现:DAN合成期(DANsynthesisphase，S期)。

第一时间间隔期（firstgap，

G1期）。

第二时间间隔期（secondgap，

G2期）。

提出：细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转（标准细胞周期，standardcellcycle)。

●1957年，3H-TdR放射自显影、Feulgen染色等证实：该细胞周期在动、植物细胞增殖中普遍存在。（一）细胞周期的时相组成

G1(Gap1)

间期S(DNAsynthesis) G2(Gap2)细胞周期 分裂期M

前期（prophase）中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase）（一）细胞周期时相组成·间期(interphase):G1phase，Sphase，G2phase·分裂期（Mphase）:有丝分裂(Mitosis)和减数分裂(Meiosis）·分裂期（Mphase）：Mitosis(nucleardivision)Cytokinesis(cytoplasmicdivision)

细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)，在M期细胞先是核分裂,接着胞质分裂，完成一个细胞周期。细胞周期ThecellcycleOverviewofthecellcycleThemostbasicfunctionofthecellcycleistoduplicateaccuratelythevastamountofDNAinthechromosomesandthensegregatethecopiespreciselyintotwogeneticallyidenticaldaughtercells.大多数大多数昆虫的受精卵、某些菌类和藻类先进行多次核分裂，形成多核细胞，然后再发生胞质分裂，在核间形成质膜，从而形成一个细胞一个核。黏菌则不发生胞质分裂。骨骼肌细胞也有多核现象。

（二）细胞周期时间·不同细胞的细胞周期时间差异很大·S+G2+M的时间变化较小,G1期的时间变化大·有些分裂增殖的细胞缺乏G1、G2期如蛙胚卵裂哺乳动物细胞周期的时间（hr）细胞类型TCTG1TSTG2+M人结肠上皮细胞259142直肠上皮细胞4833105胃上皮细胞249123骨髓细胞182124大鼠十二脂肠隐窝细胞10.42.27.01.2内釉质上皮细胞27.316.08.03.3肝细胞47.528.016.03.5·TC

＝TG1+TS+TG2+

TMTC:（细胞周期时间）·S+G2+M的时间变化较小,G1期的时间变化大

·细胞周期时间测定：细胞周期的时间长短与细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。1、脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法

3H-TdR标记，洗涤，培养，定时取样，放射自显影分析。

BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)可替代T。2、流式细胞分选仪检测法根据DNA含量分类细胞，根据类群细胞的数量推断时间。细胞周期各阶段的时间(细胞周期测定)TG2－G2期时间，TM－M期时间，TS－S期时间，TC－细胞周期时间，TG1＝TC

－（TG2

＋TM＋

TS

）2、流式细胞分选仪检测法

流式细胞仪（FlowCytometry）流式细胞仪的基本工作原理：

包在鞘液（包被细胞的液流）中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出的荧光和散射光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果。（将细胞某成分的荧光信号→电信号→叠加信号的图形）流式细胞仪的主要应用：定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；

从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；

分离DNA含量不同的中期染色体。A.细胞周期中DNA含量变化；B.流式细胞仪检测细胞周期根据DNA含量分类细胞，根据类群细胞的数量推断时间。3、缩时摄像技术

可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。（三）根据增殖状况，高等动物细胞分为三类有丝分裂周期G0G1G2SM（三）根据增殖状况，高等动物细胞分为三类EmbryocellsCyclingcellsG0cellsTerminalcells各增殖类型的代表组织细胞·周期中细胞(cyclingcell)或连续分裂细胞：如表皮生发层细胞（basalcelllayer）

、部分骨髓细胞(bonemarrowstemcells)。

·终末分化细胞（Terminallydifferentiatedcells）：不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等。·休眠细胞(G0期细胞，G0phasecell)：G0期多发生在G1期，如成纤维细胞、某些淋巴细胞、肝细胞、肾细胞等。G0期细胞和终末分化细胞的界限有时难以划分，有的细胞过去认为属于终末分化细胞，目前可能被认为是G0期细胞。（四）细胞周期中不同时相及其

主要事件◆G1期◆S期◆G2期◆M期1.G1stage（Thefirstgap,DNA合成前期）◆G1

期较其他时期长◆细胞体积增大细胞表面积∕体积之比变小;核∕质比变小◆合成各种糖类、RNA和蛋白质等

●合成各种RNA

Baserga(1956)用放线菌素D(ActinomycinD)作用于G1期的细胞，抑制RNA的合成，结果细胞就不能进入S期。●合成各种蛋白质：

G1期向S期转变的pro:触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白（触发蛋白(triggerprotein)

：一类不稳定蛋白质，只有当含量达到临界值时，才可转向DNA复制方向。钙调蛋白：核内Ca2+受体，调节Ca2+浓度；在G1末达峰值，促进G1向S转变。细胞周期蛋白(cyclin)：一类随细胞周期的变化呈周期性的出现与消失的蛋白质，在细胞周期的不同阶段表达，发挥不同的调控作用。它可以与细胞周期基因的产物（p34cdc2）结合并调节其活性，是MPF的调节亚基。）

Ieranlma和Yasukaw(1966)用蛋白质合成抑制剂抑制G1期细胞的蛋白质合成，细胞不能进入S期

合成与细胞生长、DNA复制有关的酶RNA聚合酶、DNA合成酶等◆蛋白质的磷酸化作用加强（与DNA合成启动相关）

在蛋白激酶催化下，ATP或GTP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基的过程，激活蛋白质的活性。

组蛋白（H1）、非组蛋白、激酶磷酸化◆膜转运功能增加氨基酸、葡萄糖等进入细胞◆染色质去凝集◆

G1期的变化

增殖旺盛的细胞该期时间短，衰退细胞则时间长。衰老细胞停止于G1期。许多原生动物、真菌等没有G1期。高等植物中，休眠期的种子大多处于G1期，由于所处生理条件的不同，G1期数天至数年，少数可停止在G2期。一般，不进行分裂或极少分裂的动物细胞停止在G1期。因接触抑制(contactInhibition)而停止分裂的培养细胞也停止在G1期。G1期是为S期的DNA合成做准备2.S期（DNA合成期）◆脉冲标记实验

◆S期持续时间不同

APULSE-LABELINGEXPERIMENT1.Feedradioactive

thymidine(T*)to

cellsgrowingin

culture.2.After30minutes,

washunincorporated

T*outofcellculture.3.Spreadoutcells

andlayx-rayfilm

overthem.

有丝分裂前

S期

蝾螈

12小时

小鼠

5～6小时

小麦

3.8小时

酵母

0.5小时ExperimentaldemonstrationofthecoordinatedSynthesisofDNAandhistones.◆DNA复制与组蛋白合成同步，组成核小体串珠结构核小体（nucleosome）：一种串珠状结构。构成：200bpDNA、5种组蛋白核心：4种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各2个分子组成八聚体核心颗粒；圆盘形相邻核小体：H1组蛋白结合60bp连接DNAH1锁住DNA分子进出口，稳定结构组蛋白：与组装构成染色质等有关

染色质的基本结构单位——核小体(nucleosome)

铺展染色质的电镜观察

未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现10nm串珠状结构

核小体的性质及结构要点示意图（引自B.Alberts等）

在用微球菌核酸酶降解染色质时，反应早期可得到166bp的片段，但不稳定；进一步降解则得到146bp片段，比较稳定。推测可能原因是失去H1后，DNA两端各有10bp的DNA，易被核酸酶作用而降解。多级螺旋模型核小体10nm纤维30nm纤维螺线管◆中心粒复制中心粒的发育过程（中心体周期）

微管（microtubule）的结构组成与极性MT可装配成单管,二联管(纤毛和鞭毛中),三联管(中心粒和基体中)。Arrangementofprotofilamentsinsinglet,double,andtripletMTsSingletDoubleTripletABABCInciliaandflagellaIncentriolesandbasalbodiesMT的成分-tubulin（微管蛋白）和-tubulin聚合，形成异二聚体微管蛋白上有（1）GTP结合位点：与α微管蛋白GTP结合位点结合的GTP不发生水解或交换，称为不可交换位点（nonexchangeablesite,Nsite）。微管组装时与β微管蛋白结合的GTP可发生水解，去组装后结合的GDP可交换为GTP，故称为可交换位点（nexchangeablesite,Esite）。（2）二价阳离子结合位点。（3）秋水仙素结合位点。（4）长春花碱结合位点。异二聚体组装，形成原纤维；13条原纤维，形成一根微管；有极性（即头尾）,头（－极），尾（

＋极）作用于微管的特异性药物

秋水仙素(colchicine)：与-tubulin肽链中第201位Cys（胱氨酸）结合，阻断微管蛋白组装成微管，可破坏纺锤体结构。紫杉酚(taxol)能促进微管的装配,并使已形成的微管稳定。但这种稳定对细胞是有害的，使细胞停止于有丝分裂期。◆中心粒复制中心粒的发育过程（中心体周期）

微管组织中心：在活细胞内，能够起始微管的成核作用并使之延伸的细胞结构称为微管组织中心（microtubuleorganizingcenter，MTOC）。微管组织中心决定了细胞中微管的极性，微管的负极指向微管组织中心，正极背向微管组织中心。如动物细胞中的中心体(centrosome),也存在于低等植物细胞（如衣藻、团藻等藻类植物），高等植物细胞无中心体。中心体(centrosome)中心粒（centrioles）：位于纺锤体两端，由9组三联管构成中心体(centrosome)：由一对相互垂直的中心粒及周围基质构成。

γ管蛋白：位于中心体周围的基质中，环形结构，结构稳定，为αβ微管蛋白二聚体提供起始装配位点，所以又叫成核位点

·中心粒(centrioles)结构

·中心粒复制周期

结构:9组微管三联体，中心体具有9（3）＋2结构

a:中心体及周围物质（PCM);b:9组微管三联体呈风车状排列;c:两对中心体；d:微管在MTOC上的聚合

γ管蛋白：位于中心体周围的基质中，环形结构，结构稳定，为αβ微管蛋白二聚体提供起始装配位点，所以又叫成核位点γ管蛋白成核位点成核模型及微管组装◆中心粒复制中心粒的发育过程（中心体周期）中心粒在G1中期以后开始分开。中心粒在S期复制：两个中心粒各产生了一个新的中心粒。中心体在G2晚期至M早期（前期），长大并向细胞两极移动。中心体（Centrosome）存在于低等植物细胞（如衣藻、团藻等藻类植物）和动物细胞中

◆DNA复制不同步，早期GC合成较多，晚期AT合成较多；常染色质复制较早，异染色质复制较晚；复制以多个复制子进行◆此期遗传物质较易受损，因为DNA在合成过程中核苷酸双链分开，易受致突变致癌物的影响。◆用DNA合成抑制剂处理，细胞将停留在S期。G2期◆细胞继续长大◆DNA复制完成(2n→4n)◆在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子◆中心体在G2期长大，G2晚期开始向细胞两极移动◆合成微管蛋白等,为M期纺锤体准备◆G2期DNA已经加倍，对环境较敏感，容易受温度、pH等的影响而停滞，当这些因素去除后能恢复。增殖型肿瘤细胞若在G2期，宜用放疗。◆G2期的持续时间较短。M期

◆M期即细胞分裂期，真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式，即有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞。◆染色质凝集，纺锤体形成，收缩环出现，

遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞

◆M期的持续时间较短。·Johnson和

Rao(1970)将人HelaM期细胞与袋鼠（Ptk）G1、S、G2期细胞融合诱导间期细胞的染色体发生凝缩(早熟凝集染色体PCC)：

G1期PCC为单线状，因DNA未复制；S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制；G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。提示M期细胞存在诱导PCC的因子称成熟促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。MPF促进间期细胞分裂不同形态的PCC（五）细胞周期检验点(checkpoint)细胞周期检验点：是存在于细胞周期G1、M、G2时相中调控细胞周期运行的特殊时期。主要是确保周期每一时相事件的有序、全部完成，并与外界因素（营养和激素等）和内在因素（细胞分裂周期基因cdc）相联系。

.

◆G1期检验点：酵母——Start；动物细胞——RestrictionPoint

，R点控制G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境如营养、细胞生长因子等是否适宜？细胞体积是否

足够大等？

细胞所得养分不足时：→G1→→G0人体正常器官、组织的细胞周期进程中,若发生R点的消失，自分泌大量生长因子等异常情况时，其生长、分裂将失去控制，由此形成赘生物如肿瘤。◆S期检验点：DNA复制是否完成？◆G2期检验点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？◆M期检验点（中-后期检验点，纺锤体组装检验点）：纺锤体是否形成？着丝点是否正确连接到纺锤体上？染色体是否完好？

(六）细胞周期同步化细胞周期同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化，前者称自然同步化，后者称为人工同步化。细胞周期的同步化只是暂时性的，经过几代分裂之后，细胞群又会处于周期不同步状态。1、自然同步化，◆多核体：如某种粘菌的变形体（plasmodia）只进行核分裂，而不发生胞质分裂，形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中，进行同步化分裂，使细胞核达108，体积达6~9cm。◆某些动物受精卵早期卵裂Fruitflyembryo◆某些水生动物的受精卵：如海胆卵可以同时授精，最初的3次细胞分裂是同步的，再如大量海参卵受精后，前9次细胞分裂都是同步化进行的。◆增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。2、人工同步化（1）人工选择同步化：◆有丝分裂选择法：使单层培养的细胞处于对数增殖期，此时分裂活跃。有丝分裂细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低，此时轻轻振荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，收集培养液，再加入新鲜培养液，依法继续收集，则可获得一定数量的中期细胞。其优点是，操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害，缺点是获得的细胞数量较少。（分裂细胞约占1%～2%）◆细胞沉降分离法：不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比，因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞，方法简单省时，效率高，成本低。，缺点是同步化程度较低，对大多数种类的细胞并不适用。

常用密度梯度离心法（densitygradientcentrifugation）：根据不同时期的细胞在体积和重量上存在差别进行分离。如混合细胞悬液经蔗糖密度梯度离心后，小细胞集中在蔗糖梯度的顶部，搜集起来便可进行同步培养。酵母和哺乳动物细胞培养物可用此法同步化分选。差速离心密度梯度离心（2）药物诱导同步化◆DNA合成阴断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成，而不影响其他时期细胞的运转，最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TdR对S期细胞的毒性较小，因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化。优点是同步化程度高，适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdR阻断法进行细胞同步化◆中期阻断法：利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较少。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。3、其他同步化方法◆血清饥饿法、异亮氨酸营养缺乏法等，可获得大量处于G1期的细胞。◆

温度

分裂前细胞的一些酶对温度非常敏感，高温可使分裂停止，而生物合成继续进行，因此有些细胞发生分裂的时间推迟，其他后进的细胞便趁此赶上来，达到同步化状态。Zeutnen和Scherbaum(1954)发现，将四膜虫(retrahymena)在29.5℃（最适温度）与34℃（抑制温度）两种温度下每半小时进行交替培养，经7次循环之后，再于24℃下培养，结果有85%的细胞发生了同步分裂。◆辐射分裂前的细胞对射线很敏感，辐射可使细胞在分裂前积累，随后去除辐射，细胞便在同一时间开始分裂。◆条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。（七）特异的细胞周期

特异的细胞周期是指那些特殊的细胞所具有的与标准的细胞周期相比有着鲜明特点的细胞周期。◆爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期◆酵母细胞的细胞周期◆植物细胞的细胞周期◆细菌的细胞周期1、爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期·细胞分裂快,几乎无G1期和G2期，S期也短(所有复制子都激活),以至认为仅含有S期和