组织培养解答课件

第三章离体无性繁殖离体无性繁殖的五个阶段一、培养物的建立二、诱导外植体的生长与分化三、促进中间繁殖体的增殖四、壮苗与生根五、驯化炼苗一、培养物的建立外植体的选择与灭菌外植体的接种外植体的培养二、诱导外植体的生长与分化1.顶芽和腋芽的发育：指从顶芽或腋芽中萌发的单苗或多个苗。采用外源的细胞分裂素，促使具有顶芽或没有顶芽的休眠侧芽启动生长，形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内，可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽—苗增殖的培养，从而迅速获得无数的嫩茎。2.不定芽发育2.1外植体的脱分化（去）脱分化（dedifferentiation）在组织培养中，受伤的植物树料周围细胞又可旺盛地进行分裂，产生Callus。这种原已分化，并有一定功能的体细胞（性Cell）丧失了原有的形态和机能，又回复到没有分化能力的无组织的状态。这个过程就是组织培养的去（脱）发化过程。一经去分化该材料又具有了分化的全能性能力。2.2再分化（redifferentiation）及方式（54页）

再分化：在植物组织培养中形成的处于去分化状态的Callus，是一均匀一致的细胞集团，经继代培养可能产生分化现象。这是原分化状态的细胞经去分化后，经过培养后的再次分化，称作再分化。

再分化的方式：1.体细胞胚

2.茎、芽，形成植株二者区别胚状体能形成植株，而不定芽也能形成植株，二者有什么区别呢？①起源胚状体：形成的初级阶段，多来自单个Cell，很早就具有明显的根端与菌端的两极性结构，不需诱导生根直接形成植株。不定芽：最初是由分生细胞团形成单极性的生长点，发育为芽，再转移至生根介质中，诱导形成根，然后才能形成完整的植株。②与周围Cell的联系不同胚：由胚状体发育成的小植株与周围Callus母体组织块几乎没什么结构性联系；小植株是独立的，易于分离。不定芽：不定芽与母体组织和Callus之间有着较紧密的联接，包括一些维管束组织，皮层，无表皮组织等，因而不易分离。3胚状体发生61页胚状体（embryoid）的分化，也叫体细胞胚（somaticembryo）。以胡萝卜（cowed）为试材（模式植物）。1）概念及例子2)体胚的发生方式64页3）影响体胚发生的因子65页4）体胚的实际应用74页人工种子就是将组织培养产生的体细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜，在适宜的条件下能发芽出苗的一种类似于种子的结构。

4.原球茎(protocorm)的发育在兰科或部分球根植物培养中应用较多。原球茎最初是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造，种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，胀大的胚呈小圆锥状，称做原球茎。常从茎尖、种子或侧芽的培养中产生一些原球茎，原球茎本身可以增殖，也可萌发成小植株。①培养部位：多数植物根、茎、叶和花器官各个部位都有培养成功的报道。

a新芽的茎尖部，是细胞分裂最旺盛的地方，也是成功率最高的部位，但分离较难，且破坏植株整体。

b茎的隐芽，花茎和花梗的隐芽、新叶。②培养基的选择，对于兰科花卉的培养，基本培养基的选择和植物生长调节剂的配比组合均非常重要。

常用的基本培养基有：KcVwWhiteMSB5等，种类不同，选择不同，可查资料。生长调节剂的配比，同样是种属不同，配比不同，需查文献和实验。

③组织褐变④原球茎的增殖和器官形成

将初代培养获得的原球茎，分离或个体转入新鲜培养基。

培养基：基本培养基依照种属不同而异，低浓度的CTK，液体培养基抑制芽分化，可固液交替使用。

一般增殖后的原球茎瓶内有三种状态

芽→生根or状苗

原球茎→增殖

Callus→增殖

兰花是历史上的第一件

三、促进中间繁殖体的增殖2.3.1中间繁殖体的增殖方式不同的植物种类，其生长分化的形态及特点不同，中间繁殖体的增殖方式也有所区别。概括起来主要有如下几种。1）多节茎段方式单轴茎段方式与植物的扦插方式相同，只是前者在无菌条件下，后者在自然条下；前者的基质是培养基，后者的基质是土壤或其他各种无土栽培基质。但其基本原理是一致的。方法:将外植体剪成带l~2枚叶片的单芽或多芽茎段，接种到伸长生长的培养基上。一个周期后腋芽萌发形成具有5~6节的嫩枝，如此多次继代。2）丛生芽方式培养基：为了促进丛生芽的形成，细胞分裂素与生长素的比值应该较大。但是细胞分裂素的浓度不宜过高，否则多次继代后会造成外源激素在体内的积累，而抑制内源激素的作用，使植物生长封顶，茎细弱，叶片细小卷曲，形成类似莲座状的结构。所以，在进行培养时，要注意激素的搭配比例，或与其它种类的细胞分裂素进行一定轮次的交替使用，增加生产的稳定性，降低无效苗消耗。但增殖过程中要尽量避免基部愈伤组织上形成的不定芽，尤其不能将不定芽用于中间繁殖体的继代增殖，以增加生产的稳定性。不同植物种类，甚至不同品种，丛生芽的增殖能力差异比较大，进行大规模的商业化生产时，应注意及时调整培养基，减少各种无效消耗。这种繁殖方式是目前生产中应用最普遍的类型。应用：这种方式与短枝扦插型类似，遗传性状稳定，而且成苗速度快，繁殖量大，适合于大规模的商业化生产，适合丛生型植物种类，如非洲菊、菊花、玉簪、萱草等。3）不定芽再生方式方法：从离体培养的叶片、茎段(不带腋芽)直接再生不定芽或在脱分化所形成的大量愈伤组织块上再分化出大量小不定芽，将不定芽转入生根培养基，同时将能再生不定芽的器官或愈伤组织块再继代培养，如此反复可达到快速、大量繁殖的目的。应用1：但是通过这种方式再生的植株在遗传上的稳定性较差（分化部分已详述），而且随着继代次数的增加，愈伤组织再生植株的能力会下降，甚至完全消失。应用2：因此这种增殖方式在植物组织培养中应用不多，只见于一些特殊的种类或特殊的用途，如秋海棠叶片培养、转基因月季叶圆片培养等。4）原球茎途径原球茎途径是兰科和其他球根植物特有的一种再生方式。方法：在兰花组织培养中，常从茎尖或侧芽的培养中产生一些原球茎，原球茎本身可以萌发成小植株，也可作为中间繁殖体进行增殖。原球茎的增殖速度非常快，无性增殖应在转绿前将原球茎切割成小块，也可以给予针刺等损伤，或在液体培养基中振荡培养，来加快其增殖进程。原球茎经过一段时间培养后逐渐转绿，并长出毛状假根，叶原基发育成幼叶。待苗长到一定高度时可以转入生根培养，形成完整的植株。应用：目前，这种增殖方式是兰科和部分球根植物组培生产中使用的方式。5）胚状体途径通过体细胞胚的发生来进行无性系的大量繁殖具有极大的潜力，其特点是成苗数量多、速度快、结构完整。在生产中应用此方式作为中间繁殖体进行增殖的很少。2.3.2影响增殖生长的因素1）无机养分2）有机养分

(1)维生素及肌醇

(2)腺瞟呤

(3)糖3）植物生长调节剂4）继代周期和继代次数5）其它条件（1）光照（2）温度四、组培苗的壮苗与生根培养当继代繁殖一定数量后，培养室的容量就会饱和，必须分流进入壮苗、生根培养阶段。因此，在生产中，继代的次数与繁殖的数量要计划准确，即繁殖了一定的数量又不超过继代限度，达到工厂化育苗规范标准的最佳效益。4.1瓶内生根壮苗

1.降低无机盐浓度：培养基内矿物元素浓度高时有利于发生茎叶，较低时有利于生根，所以生根培养基多采用1/2基本培养基或1/3、1/4大量元素培养基。

2.生长素有利于诱导生根：IAA、IBA、NAA等。当小植株生出3-5条水平根，每条根长2-3cm时，为最适宜的出瓶炼苗阶段。

3.增加光照强度，提高组培苗的自养能力，加强光合作用。

4.降低糖的浓度，减少糖的供应，促其自养，加强光合作用。4.2瓶外生根在有些植物中，把在离体条件下形成的纸条当做微型插条处理，把使其在适当的基质中生根。把插条的基部切口先用促进生根的物质（生长素、生根粉）处理，在将其扦插在适当的基质中。4.3无根苗的嫁接当瓶内诱导生根困难或市场拒绝自根苗时，嫁接就是非常好的方法。

1.瓶内嫁接，也叫微型嫁接：接穗：0.1-0.2mm长的茎尖。砧木：瓶内带根的无菌苗。

2.瓶外嫁接，应用在无籽西瓜，瓠子为砧木，三倍体无籽西瓜为接穗。五、组培苗的驯化与移栽

5.1组培苗的驯化

5.2组培苗的移栽

1.移栽基质的选配要选择恰当的种植介质，以利植物疏松、透水、通气，同时具有适宜的保水性、容易灭菌处理，不利于杂菌滋生等也是选择介质的重要条件。一般来说，无土栽培所用的基质均可用于试管苗的移栽，常用粗粒状蛭石(过细的蛭石粉并不适宜)、珍珠岩、粗沙、炉灰渣、谷壳(或谷炭壳)、锯木屑、腐殖土、泥炭土、水草等。或者根据植物种类的特性，将它们以一定的比例混合应用，应用最多的例子是取蛭石和泥炭土按1：1比例混合。试管苗生长的环境是无菌的，为了防止微生物的侵染，要在移栽前对基质进行消毒。一般用5%的高锰酸钾水溶液消毒，也可用其他杀菌剂或高温处理。管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系的呼吸，有助于生根成活。这些介质中，尤其是有机基质一般不要重复使用，如重复使用，在使用前应用清水浸泡，洗去其中的盐份和其他有害物质，并进行暴晒或高压灭菌。2.移栽后管理1)适量的洁净度试管苗原来的环境是无菌的，出瓶种植环境难以保持完全无菌，但应尽量减少杂茵大量滋生，才能保证试管苗过渡成活。除栽培基质要预先灭菌外，进行喷雾或浇水时，适当使用一定浓度的杀菌剂可以有效地保护幼苗，预防病虫害发生，如百茵清、多菌灵、甲基托布津等药剂。2）适宜的湿度在试管或培养瓶中的小苗，因湿度大，茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全无，根系也不发达或无根，出瓶种植后很难保持水分平衡，即使根的周围有足够的水分也不行。所以，只有提高周围的空气湿度(达90%~100%)，使叶面的蒸腾减少，尽量接近试管或培养瓶培养中的条件，使小苗始终保持挺拔的姿态。尤其在移栽最初的10天内，保持周围空气的高湿度(达90%~100%)比基质中的水分更重要。随着小苗逐渐成活，降低空气湿度，并保持基质中适宜的持水量。若不及时移栽，要定期施以稀薄的营养液，供小苗生长所需。3）适宜的光照度试管苗原来是有糖等营养供应的，出瓶后要靠自己进行光合作用维持生存，而叶片的光合功能尚不健全，光照不能太强，以漫射光为好，最好能够调节，随苗的壮弱、喜光或喜阴、种植成活的程度而定。约在1500~40001x甚至达10,0001x之间。光线过强会使叶绿素受到破坏，引起叶片失绿、发黄或发白，使小苗成活延缓。过强的光线还能刺激蒸腾作用加强，使水分平衡的矛盾更加尖锐，使小苗有灼烧伤害，引起大量死苗。4）适宜的温度

7.胚乳培养的概念及方法

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胚乳培养

2.1含义

将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。3胚乳培养的方法3.1胚乳愈伤组织的建立绝大多数经历愈伤组织阶段（器官发生），极少数直接从胚乳直接分化器官(胚状体)。3.2胚乳发育时期发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。处于旺盛生长期的胚乳，离体条件下最易诱导产生愈伤组织